【摘 要】 目的：研究人牙胚不同发育时期Calbin din-D28K（CaB）的表达，以期分析CaB在人牙体硬组织形成过程中的作用，为探明人牙齿 矿化 过程中经细胞钙转导机制提供实验依据。方法：免疫组化ABC染色。 结果：人牙胚蕾、帽状期成釉器无CaB的表达；钟状早期成釉器 的内 釉细胞及部分牙乳头表面处于分化状态的细胞弱阳性染色；钟状晚期成釉器的成釉细胞、成 牙本质细胞及部分胞核呈现强阳性染色。结论：CaB参与了人釉质及 牙本质的形成过程，并且在人牙胚发育过程中的CaB表达具有时间特异性及细胞特异性 。
Calbindin-D28 K（CaB）是一种主要存在于细胞浆中、Mr为27.8×103的可溶性蛋白质 ，属于钙结合蛋白（Cancium-binding protein CaBP）家族中的一员。它与细胞内游离钙离 子有高度亲和力，从而可介导调节钙离子参与包括硬组织的矿化等多种生理功能［1，2 ］，尤 其在生物体硬组织矿化过程中，对经细胞钙转导具有重要作用［3］。自CaB发现以来 ，一些学者 运用免疫组织化学［4，5］、放射免疫分析［6］、蛋白质印迹［7］以 及原位杂交［8，9］等技术对其在与钙平衡密切相关的肾、骨、小肠、神经系统等诸 多组织中的分布研究较多。对于CaB在牙胚发育过程中的分布，由于取材的限制，大多局限 在动物牙胚的研究［10，11］，而有关人牙胚发育过程中CaB的分布报道甚少。本 文采用免疫组化技术，对不同发育时期的人牙胚中CaB的分布进行观察，进而探讨CaB在人牙 体硬组织形成中的作用，以期为深入研究人牙齿矿化过程中经细胞钙离子转导机制提供实验 依据。
1 材料和方法
1.1 组织和抗体准备
选择胎龄约14和24周合法引产胎儿各1个。
取上、下颌骨，40g/L多聚甲醛液（pH7.3 , 0.01mol/L PBS）固定24h，4℃ EDTA脱钙，700～1000ml/L乙醇逐级脱水，石蜡包埋，垂直切片，片厚6μm，每例标本选2张做HE染 色，确定发育时期， 其余进行免疫组化染色。
Calbindin-D28K单克隆抗体（美国Sigma公司C-8666），工作浓度1：200。
SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。
1.2 免疫组化染色
采用ABC法，切片脱蜡至水，新鲜配置30ml/L过氧化氢灭活内源性酶10min；滴加 复合消化液10min；滴加正常血清封闭液室温20min，滴加一抗，4℃湿盒过夜；37℃复温1 h；湿盒中加二抗37℃孵育1h；滴加SABC 37℃ 20min；DAB- H2O2显色。镜下控制 反应时间。上述各步之后均用PBS振洗3次，每次5min，对照用PBS代替一抗，其余步骤相同 ，标本用苏木精复染胞核。
2 结果
蕾状期成釉器中染色阴性（图1）。帽状期成釉器中染色阴性（图2）。钟状早期成釉器 中，成熟的内釉上皮诱导牙乳头中的间充质细胞分化为成牙本质细胞，但尚未见硬组织形成 ，其中牙乳头表面处于分化状态的细胞部分染色弱阳性（图3）。钟状晚期成釉器中，成熟 的内釉上皮分化为成釉细胞，成熟的成牙本质细胞也开始分泌前期牙本质，此时的成釉细胞 及成牙本质细胞呈现强阳性染色；中间层及星网层的部分细胞也呈现阳性染色；牙乳头细胞 中阳性细胞分布不均，其中，靠近成牙本质细胞的牙乳头细胞多为阳性，并且越接近硬组织 形成区染色越强。一些成熟成釉细胞及成牙本质细胞的细胞核中也有染色（图4）。
图1 蕾状期成釉器中染色阴性（ABC,×100）
图2 帽状期成釉器中染色阴性(ABC, ×100)
图3 钟状早期成釉器，成熟的内釉上皮（I）、牙乳头表面处于分化状态的细胞 (P)中CaB 弱阳性(ABC, ×400)
图4 钟状晚期成釉器，成釉细胞(A) 、 成牙本质细胞 (O) 、
中间层细胞(S) 、牙乳头细 胞(P) 中均呈现CaB强阳性(ABC, ×400)
3 讨论
目前所发现的介导、调节细胞内钙的钙调蛋白有200多种，作为CaBP家族中具有VitD依赖性 的 成员CaB，在多种动物的多种组织中广泛分布，且其分布具有时间特异性和分布区域的特异 性［12］，CaB还具有多种重要的作用：可作为载体蛋白，有助于加强钙离子的易化 扩散，即 参与细胞内钙转导；可以高亲和力结合钙离子，即可能作为钙离子的缓冲蛋白参与调节；可 作为钙敏感调节蛋白与钙转运系统的其它分子如D9K、OC、CaM等协同作用；可与ALP发生钙 离子依赖性结合，从而激活一系列其他的细胞内反应；CaB还可能改变胞膜上钙通道蛋白的 活性，从而选择性增加细胞膜对钙离子的摄取；也能够进入细胞核中，其作用可能是参与某 些基因活性的调节。可见，CaB可作为转运酶、蛋白或泵帮助调节细胞内钙离子浓度。因 此它与硬组织的矿化密切相关［13］。
