【摘 要】 目的：利用免疫酶组化染色技术，对人 恒前磨牙成牙本质细胞突内的波形蛋白进行定位研究。方法：将牙齿拔除后立即磨成薄片，100ml/L中性福尔马林液固定72h，100ml/L硝酸脱钙。石蜡 包埋，制取6μm厚的组织切片。采用SABC法进行免疫组化染色。 结果：阳性染色的波形蛋白结构在牙本质小管内呈连续较直的长条 状。在冠部至釉牙本质界，在根部达牙本质小管末端。其分布趋势是从牙本质内层到外层逐 渐减少，阳性表达程度逐渐减弱。结论：成牙本质细胞突贯通牙本 质全层达牙本质小管末端。
关于成牙本质细胞突在牙本质小管内的长度一直存在争论。本组根据 成牙本质细胞突的结构特点，利用免疫酶组织化学染色技术，对成牙本质细胞突内的骨架成 分波形蛋白进行定位研究，以了解成牙本质细胞突在牙本质小管内的分布情况。
1 材料和方法
1.1 标本来源
选用14～20岁患者的6个因正畸需要而拔除的健康恒前磨牙，牙齿拔下后立即在喷水砂轮机 上磨成颊舌向2～3mm厚的薄片，置100ml/L中性福尔马林液室温固定72h。用pH 7.4 PBS缓 冲液洗涤1h后，将牙齿放入100ml/L硝酸溶液中室温脱矿，脱矿液每2天更换1次。脱矿后的 牙齿用PBS洗涤过夜，系列脱水，60℃石蜡包埋，制取6μm厚组织切片，60℃干燥2h。
1.2 试剂
单克隆鼠抗人波形蛋白抗体(丹麦Dako公司)，应用时稀释至1:50；即用型SABC试剂盒(美国V ector公司)。
1.3 免疫组化染色
按SABC试剂盒使用说明进行。阴性对照用PBS代替单抗，阳性对照选用牙髓组织，其余步骤 同上。光镜观察。
2 结果
阴性对照组切片无特异性染色。阳性对照组切片波状蛋白呈棕色，未见非特异性染色。 实验组切片背景为浅色，阳性标记的波形蛋白位于牙本质小管内呈深棕色，外形为连续 长条状，在小管外1/3略呈波浪形。从小管内层到外层着色程度逐渐减弱，长条由粗变 细。 波形蛋白在全层牙本质的分布是内1/3极为丰富，中1/3、外1/3逐渐减少。在冠部分布至釉 牙本质界，在根部至牙本质小管末端(图1、2)。
图1 波形蛋白由冠部近牙髓端向牙本质层延伸 ×400
图2 波形蛋白在牙根部达牙本质小管末端 ×400
3 讨论
成牙本质细胞突在牙本质小管内的长度一直存在争论，无论是动物牙齿还是人牙，研究 者采用的研究方法不同所得结果也不一致［1，2］。
透射电镜［1］和免疫荧光研究［3］表明，成牙本质细胞突含有一个由 微管、微丝和中间丝组成的网状结构，它们是细胞骨架的重要成分，不存在于细胞体外。本 文作免疫酶组化染色时选用了中间丝波形蛋白，因成牙本质细胞是高度分化的结缔组织细胞 ，属间叶组织，中间丝波形蛋白特异性地分布于间叶组织中，维持着细胞和细胞器的形态和 完整性，故以波形蛋白抗体定位牙本质中抗原的存在可反映牙本质中成牙本质细胞突的分布 。
标本的制备至关重要。免疫酶组织化学染色技术具有免疫放大作用强、阳性定位准确的优点，常用的方法是将牙齿从釉 牙骨质界截断后固定和将牙齿近、远中向劈开后固定。所用固定液有多聚甲醛复合物(PLP) 、戊二醛或戊二醛混合液等。脱钙大多用EDTA。Sigal等人［4］利用管状蛋白、肌纤 元和波形蛋白抗体对人成牙本质细胞突进行免疫荧光研究时，采用了将牙齿拔下后立即劈成 两半、PLP固定、用含5g/L多聚甲醛的120g/L EDTA脱钙62d的标本制备方法；本文所用的方 法与之相比 ，标本的制备时间短、所用试剂简单；另外由于是牙本质全层同时接触固定液，福尔马林渗 透力较强，因此极利于标本的固定。本组采用了即用型SABC试剂盒,一抗浓度采用1:200、 1:150、1:100和1:50,每次在技术上都设阳性和阴性对照,结果以1:50时的染色效果较好,波 形蛋白阳性染色纤维呈棕色，可见棕色颗粒,而背景呈淡色。阳性对照切片未见非特异性染 色。在人恒前磨牙牙冠部成牙本质细胞突分布达釉牙本质界，与Sigal等［4］的免 疫荧光研究报道一致。波形蛋白阳性染色纤维呈较直的长条状走行于牙本质小管内，其分布 趋势是从牙本质内1/3到外1/3逐渐减少，染色变淡；牙根部的成牙本质细胞突分布达牙本质 小管末端，波形蛋白阳性染色纤维分布趋势与冠部相似。
