【摘 要】 目的: 观察骨形成蛋白特异的细胞内信 号转导分子Smad1在人牙胚发育过程中的表达变化，探讨Smad1在牙齿发育过程中的 作用。方法：制备人牙胚发育各期标本，免疫组化方法观察Smad1在人牙 胚发 育过程中的表达情况。结果：Smad1在牙胚发育的不同时期均可 见不 同的时空表达模式。结论：观察到Smad1信号分子在人牙胚发 育过程中的表达，Smad1可能在牙胚各期的发育起一定的作用。
骨形成蛋白（BMPs）属于TGF-β超家族，在牙胚发育中发挥重要的 调控作用。文献［1～5］表明，BMPs在牙胚的发生、成牙本质细胞的分化、第三 期牙本质的形成均发挥重要的作用。Smad1是最近发现的BMPs细胞内信号转导分子 ［6］ ,BMPs受体在牙胚发育和成牙本质细胞分化的作用已有文献报道［7］ 。但对于BMP 受体下游的信号分子在牙齿发育中的作用，文献报道甚少。本实验通过连续的人牙 胚切片，观察Smad1的表达变化，探讨Smad1在牙胚发育过程中的作用和意 义。
1 材料和方法
1.1 标本来源
取4例合法引产的约4～6月龄胎儿，截取上、下颌骨，40g/L 多聚甲醛液(pH7.3，?0.1mol/ L PBS )颈动脉灌注固定，4℃下100g/L EDTA脱钙1月，常规方法脱水，石蜡包埋，制备5μm厚的 连续石蜡切片，免疫组化染色。
1.2 免疫组化主要试剂
Smad1多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology,Inc.进口原装）。ABC试剂盒和DAB试剂 盒(武汉博士德公司)。
1.3 免疫组化染色
采用ABC法，切片脱蜡至水，3ml/L H2O2室温下10min以消除内源性过氧化物酶，1g/L胰 蛋白酶消化，正常羊血清孵育30min，滴加羊抗人Smad1抗体（1：200），4℃湿盒过夜 ，3 7℃复温1h，滴加生物素化二抗,37℃孵育30min，滴加酶结合物,37℃孵育30min，DAB显微镜 下控制显色5～10min。上述各步之后均用0.01mol/L PBS振洗3次，每次5min。用大鼠颌骨组 织切片作为阳性对照,用0.01mol/L PBS缓冲液代替一抗染色的切片作阴性对照, 苏木精复染 ，常规脱水,二甲苯透明,封片。
2 结果
蕾状期：Smad1在牙板和成釉器为阳性表达（图1）。帽状期：Smad1在成釉器内 釉上皮 细胞呈强阳性表达，外釉上皮星网状层细胞阴性表达，牙囊、牙乳头弱阳性表达（图2）。 钟状早期：内釉上皮Smad1强阳性表达、中间层细胞阳性表达，牙乳头弱阳性表达（图3 ）。钟状晚期：Smad1在成釉细胞、成牙本质细胞为强阳性表达，牙乳头细胞为阳性表 达，其它细胞呈阴性（图4）。
图1 蕾状期：Smad1阳性表达细胞主要位于牙板上皮和成釉器，邻近间充质细胞为弱阳 性表达 (40×)
图2 帽状期：成釉器内釉上皮细胞可见Smad1呈强阳性表达，牙囊、牙乳头为弱阳性表 达 (40×)
图3 钟状早期：内釉上皮细胞Smad1可见强阳性表达，中间层细胞阳性表达， 牙乳头弱阳性表达 (40×)
图4 钟状晚期：成釉细胞、成牙本质细胞Smad1为强阳性表达，牙乳头细胞为阳性表达 (40×)
3 讨论
在牙胚发育过程中，上皮-间充质之间的相互作用调控其形态的发生和细胞的分化。文献 ［1～5］表明，BMPs在牙胚发育过程中发挥重要的作用。Vainio 等［3］研究鼠 牙胚发育各期BMP2、BMP4的时空分布模式，认为BMP2、BMP4很可能是决定牙胚间充质细胞 发育方向的上皮-间充质相互作用中的信号诱导分子。Heikinheimo等［4］研究发现B MP6早期表达于牙上皮，以后主要表达在前期成牙本质细胞和成牙本质细胞，BMP5表达较晚 ，且仅出现于成釉细胞。Helder等［5］发现在帽状期和钟状早期内釉上皮可见大量 的BMP7表达，牙胚各期未见BMP3的表达，牙囊可见大量的BMP3表达。
BMPs在牙胚发育和成牙本质细胞分化中的作用是BMPs和细胞表面的BMPs受体结合后，将信号 传导至核内，调节相应的基因表达，促进细胞的分化。与BMPs信号传导有关的受体是BMPs的 Ⅰ、Ⅱ型受体。BMPs同时与Ⅰ、Ⅱ型受体结合，在此过程中，Ⅱ型受体使Ⅰ型受体活化 ，活化的Ⅰ型受体再作用于下游分子，将信号传导至核内［7,8］。Hoodless等(1996 )［6］克隆成功Smad1，功能研究证实，Smad1是BMP受体下游的信号分子。 关 于Smad1在牙胚中的时空分布研究，国内外未见报道。本实验结果表明，蕾状期牙板和 成釉器上皮均 可见Smad1阳性表达，而邻近的间充质细胞则为弱阳性表达；帽状期和钟状早期Smad 1主要分 布于内釉上皮，牙乳头细胞分布较少；钟状晚期，即硬组织形成期，牙乳头细胞Smad1 表达 增加，特别是成牙本质细胞和成釉细胞Smad1表达显著增强。Smad1在牙胚各期的分 布表明： 在牙齿发育早期，Smad1可能参与早期的上皮-间充质相互作用的信号诱导，这与BMP2和 BMP 4的功能较相似；随着牙胚的发育，Smad1在牙乳头间充质表达逐渐增加，特别是成牙本 质细胞和成釉细胞，这与BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7的分布有相似之处。
