【摘 要】 目的：观察转化生长因子-β超家族的 细胞内信号转导分子Smad4在人牙乳头细胞内的表达及信号转位过程。从细胞内信号转 导水平探讨牙齿发育过程中成牙本质细胞的分化机制。方法：原代 培养人牙乳头细胞，用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)和 骨形成蛋白-2(recombinant human bone morphogenntic protein,rhBMP-2)刺激培养的细胞 ，免疫组化观察。结果：TGF-β1和rhBMP-2实验组胞核内均可见S mad4蛋白强阳性表达，但胞浆 内未见Smad4蛋白阳性表达；对照组胞浆内可见Smad4蛋白阳性表达，核内未见阳性 表达。结论：观察到Smad4在人牙乳头细胞内的表达并参与信号 转位过程，提示Smad4可能同时参与TGF-βs和BMPs的细胞内信号转导过程。TGF-βs和B MPs 在牙齿发育中信号传递可能都是通过Smad4的信号传导途径实现的。
在牙胚发育过程中，上皮-间充质之间的相互作用调控其形态的发 生和细胞的分化。其相互作用是通过釉上皮分泌的信号分子通过基底膜 活化后诱导间充质细胞 凝聚，凝聚的间充质细胞表达并分泌细胞因子和基质蛋白，细胞和细胞、细胞和基质蛋白之 间的相互作用导致成牙本质细胞分化完成。文献［1～5］表明，TGF-βs和BMPs 是主要的信号分子，参与早期的牙胚发育、成牙本质细胞分化和第三期牙本质形成。一般认 为，TGF-βs和BMPs以自分泌和旁分泌的方式调控自身在牙齿发育和牙本质形成中的作用。 但TGF-βs和BMPs如何调控自身在细胞内的表达和分泌，以及如何调控胞外基质的分泌？目 前 仍不清楚。Smad4是转导TGF-βs和BMPs细胞内信号的共同中介分子，本实验观察体外培 养的人牙乳头细胞内是否存在Smad4的表达，以及Smad4是否参与TGF-βs和BMP s细胞内信号传导，探讨成牙本质细胞分化和第三期牙本质形成机理。
1 材料和方法
1.1 人牙乳头细胞原代培养和实验分组
选择合法引产的4～5月龄胎儿，取其牙乳头，组织块法［6］原代培养人牙乳头细胞 。 培养液为含150ml/L胎牛血清（FCS）的DMEM培养液（Gibco,USA）。取生长良好的第5代牙 乳头 细胞，用2.5g/L胰酶消化后，以2×104/L细胞浓度接种到24孔板中，将处理好的盖玻片预 先 放到24孔板中，待细胞基本爬满盖玻片后，换用含100pmol/L TGF-β1（Promega）和10nmol /L rhBMP-2(本校生化教研室刘新平教授惠赠)的2ml/L FCS的DMEM培养液培养，对照组继 续用 2ml/L FCS的DMEM培养液培养，不加任何刺激。培养1h后取出盖玻片，40g/L多聚甲醛 固定30 min ,备用。
1.2 免疫组化染色
采用SABC法(武汉博士德公司提供试剂盒)，常规免疫组化染色。
2 结果
TGF-β1实验组，可见人牙乳头细胞胞核Smad4强阳性，胞浆内弱阳性(图1)；rhBMP-2 实验组，亦可见细胞胞核Smad4强阳性表达，胞浆内未见Smad4表达（图2）；对照 组，牙乳头细胞胞浆内可见Smad4 阳性表达，胞核内未见表达(图3)。
图1 TGF-β1组：人牙乳头细胞胞核Smad4强阳性表达，胞浆弱阳性表达 (SABC法，40 ×)
图2 rhBMP-2组：人牙乳头细胞核Smad4强阳性表达，胞浆弱阳性表达 (SABC法，40 ×)
图3 对照组：人牙乳头细胞胞浆Smad4强阳性表达，胞核未见表达 (SABC法，40×)
3 讨论
TGF-βs和BMPs在牙齿胚胎发育过程中上皮-间充质相互作用所发生的一系列信号传导过 程中发挥重要的调控作用。近来研究［5］发现，在鼠牙胚发育早期，未来牙板形成 处 增厚的原口腔上皮中先出现BMP4的表达，随后出现BMP2的表达，BMP2的表达一直持续到帽状 期，之后BMP2的表达转入牙乳头间充质中。认为BMP2很可能是决定牙胚间充质细胞发育方向 的上皮-间充质相互作用中的信号分子。TGF-βs则在牙板上皮和牙胚发育的各期均见表达 ［2］，表明TGF-βs在牙齿发育中发挥重要的作用。TGF-βs和BMPs成功地诱导体外 培养的人牙乳头细胞和牙髓细胞分化［1,3］，表明TGF-βs和BMPs在成牙本质细胞 分化和第三期牙本质形成中发挥重要的作用。
