［摘 要］目的：通过检测牙胚发育不同阶段牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达情况，探讨其在牙齿发育过程中的作用。方法：采用免疫组织化学染色技术，观测小鼠牙齿发育各阶段标本中DSPP的表达。结果：DSPP的蛋白表达始于钟状中期，在内釉细胞和正在极化的成牙本质细胞中表达，牙体组织形成开始，则转至成牙本质细胞，直至牙冠硬组织完全形成。此阶段在成釉细胞有反复表达。牙齿萌出时，该蛋白无论在成牙本质细胞还是在成釉细胞表达均为阴性。结论：DSPP在牙胚发育过程中的表达具有时空特异性；它可能在牙冠硬组织的形成，牙齿萌出时间点的确定方面具有重要作用。
［关键词］牙本质涎磷蛋白；小鼠；牙齿发育；蛋白表达
牙本质涎磷蛋白(DSPP）是牙本质磷蛋白（DPP）和牙本质涎蛋白（ DS P）基因复合体［1，2］。该基因的发现为更好的了解牙本质特异蛋白提供了物质和 理论基础。最近，江卫民等通过蛋白印迹实验(Western blot)证实小鼠牙齿组织中存在DSPP 蛋白，但对DSPP在牙齿整个发育中的表达特性未做进一步的研究［3］。本研究首次 采用免疫组化技术，通过观察DSPP在小鼠牙齿发育不同阶段的表达状况，探讨DSPP在牙齿整 个发育中的作用。
1 材料和方法
1.1 标本制备
取BALB/c小鼠孕16～19d（雌雄同笼，出现阴栓为0天）胎鼠及生后1～6、8d子鼠各3只，断 颈处死后分离并切取含磨牙的上颌骨，置4℃?40g/L多聚甲醛中固定24h，系列乙醇脱水， 石蜡定向包埋，行冠状4μm切片。
1.2 免疫组化染色（SP法）
石蜡切片脱蜡至水，3ml/L?H2O2-甲醇室温孵育30min 以消除内源性过氧化物酶活性， 1g /L胰酶37℃消化30min，100ml/L正常山羊血清室温封闭30min，倾去血清，滴加1:50稀 释的 兔抗小鼠DSPP多克隆抗体，4℃过夜。37℃复温1h，滴加1:100稀释的生物素标记二抗（Zyme d），37℃孵育30min，最后滴加1:100辣根酶标记链霉卵白素（Zymed），37℃孵育30min。 以上每一步骤后用0.01mol/L PBS缓冲液振洗3次，每次5min。滴加新鲜配置的DAB显色液， 镜下控制显色,苏木精复染，二甲苯透明、封片。阴性对照由正常兔血清替代一抗。
2 结果
DSPP在帽状期及钟状早期牙胚（孕16～17d）中呈阴性表达（图1），钟状中期（孕18～19d ）在内釉细胞表达。此时，内釉细胞所对应的分泌期前成牙本质细胞（presecrator y odontoblast）呈弱阳性表达。钟状中晚期（生后1～2d），釉-牙本质界，正在极化的成 牙本质细胞（polorizing odontoblast，PolO）、功能型成牙本质细胞（functional odont oblast FO）、成熟型成牙本质细胞（mature odontoblast，MO）及它们所对应的前成釉细 胞（对 应PolO ，FO）表达均为强阳性；靠近牙尖的部分成釉细胞呈弱阳性；而牙尖处成熟的成釉 细胞表达为阴性（图2、3）；硬组织形成、矿化期（生后3～6d），成牙本质细胞表达 较强 ，直至牙冠硬组织完全形成；牙冠形成后期（6d），当牙尖处的成釉细胞开始与外釉细胞、 星网层细胞结合时，此处成釉细胞再次表达DSPP（图4）；缩余釉上皮细胞已形成，牙齿萌 出时，该蛋白在成牙本质细胞弱表达而在成釉细胞中的表达又转为阴性。
图1 钟状早期牙胚，免疫组化染色法 (×20 SP法)
图2 钟状中晚期牙胚，免疫组化染色法 (×10 SP法)
图3 钟状中晚期牙胚，免疫组化染色法 (×40 SP法)
图4 硬组织形成后期，免疫组化染色法 (×20 SP法)
3 讨论
DSPP基因是DPP及DSP的联合体，它的发现使得对于牙本质形成机理的研究进入了一个新 的领域。本研究结果显示：DSPP的表达有一定的时空特异性。它在小鼠磨牙帽状期及钟状早 期无表达（与在大鼠牙胚进行的原位杂交结果一致［4，5］），而在细胞分化早期（ 分 泌期前成牙本质细胞和前成釉细胞）和成牙本质细胞其他各期（PolO 、FO及MO）的表达说 明，无论成牙本质细胞分化的阶段如何，DSPP的表达具有相同的调控途径。
