［摘 要］目的：探讨胶质源性神经营养因子(GDNF)在牙髓炎症中的表达变化及意义。方法：应用免疫组织化学方法比较正常和炎症状态下，GDNF在牙髓组织中的变化。结果：正常牙髓组织GDNF染色呈阴性，炎性牙髓组织染色GDNF呈阳性，其主要分布在牙髓组织成牙本质细胞和成牙本质细胞深层细胞，而牙髓神经雪旺氏细胞染色为阴性。结论：GDNF参与牙髓炎性反应，与炎性牙髓组织再生发芽有关。
［关键词］胶质源性神经营养因子；神经生长；免疫组化
胶质源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)，是一种新发现的神经营养因子，为TGF-β家族成员之一。其促神经再生作 用较NGF强［1］，对牙胚神经组织的发育形成起促生长作用，在牙髓神经发育形成过 程中起重要的促生长作用［2］。本实验旨在观察大鼠牙髓炎症状态下和正常状态下G DNF在牙髓组织中的变化，并作对比性研究，利用免疫组织化学染色直观再现GDNF在参与牙 髓炎症时的表达部位，探讨其对牙神经再生修复的作用和意义。
1 材料和方法
1.1 牙髓炎动物模型建立
SD大鼠24只，雌性，体重200～240g，其中4只做正常对照，余20只用846药 液（解放军农牧大学军事长春兽医研究所)0.5ml/kg注射鼠股外侧肌群，待10min后鼠完全麻 醉，于右侧上、下颌第一磨牙牙 合面穿髓，用5g/L 浓度的γ-内毒素(sigma，USA)作用于穿髓点15min后，玻璃离子水门汀封闭，建立牙髓 炎动物模型，实验分5组，炎症3、6、9、12、15d组［3］。
1.2 样本制备
用30g/L戊巴比妥钠腹腔深度麻醉后开胸，经升主动脉灌注生理盐水100～150ml ，换含40g/L多聚甲醛液的0.1mol/L磷酸缓冲液350～450ml灌注固定1h,取带有完整牙齿 的上、下颌骨。标本浸入40g/L多聚甲醛液后固定2～4h，放入Krinstensen\'s脱钙液脱钙7d ，浸蜡包埋，石蜡切片，片厚15μm。
1.3 免疫组织化学染色
标本切片经脱蜡至水，PBS(pH=7.4)振洗， 30ml/L过氧化氢液封闭内源性过氧化物酶10min ， 室温。加入GDNF抗体1：25（北京中山生物技术公司，），4℃孵育24 h；加入生物素化二 抗,37℃,孵育 1h；加入复合物；DAB 镜下控制显色，自来水终止反应。系列乙醇脱水， 二甲苯透明，DPX胶封片。显微镜下观察并照相。本实验中用生理盐水代替一抗作为空白对 照组。
2 结果
空白对照组、正常对照组标本染色为阴性。炎症3d组切片组化染色为弱阳性(图1)。炎症6 、9、12、15d各组GDNF在成牙本质上染色呈不同程度的阳性反应，显微镜 下观察，炎症坏死区残留的成牙本质细胞和成牙本质深层细胞胞浆着色，为黄褐色，牙 髓成纤维细胞染色阴性，牙髓神经雪旺氏细胞染色也为阴性(图2)。除3d组外，各组GDNF在 成牙本质细胞上阳性染色深浅差异不显著。
图1 牙髓炎症3d组GDNF于成牙本质细胞(OD)染色阳性，
成纤维细胞(FB) 染色阴性 (×100)
图2 牙髓炎症12d组GDNF于成牙本质细胞(OD)染色阳性，
成牙本质深层(SB)染色阳性，神经 雪旺氏细胞(SC)染色阴性 (×100)
3 讨论
GDNF是从胶质细胞瘤(B49)中发现并克隆成功的，故称之为胶质源性神经营养因子。研究发 现GDNF不仅存在于中枢神经系统纹状体黑质，也存在于外周神经系统靶器官，如发育中的 牙齿、 内耳、眼、舌乳头、嗅上皮，对感觉神经有营养活性［4，5］。目前普遍认 为GDNF是通过与G DNF-α和C-Ret两种受体结合形成GDNF-GFRα-cRet复合体，激活 C- Ret酪氨酸蛋白激 酶 活性，导致一系列底物蛋白的磷酸化反应，而发挥GDNF的生物活性效应［6，7］。
牙齿发育过程包括了上皮与间充质细胞间的作用，及细胞外基质成分之间的相互作用， 有多种生长因子参与此复杂过程，神经营养因子在其中发挥不可忽视的作用。大部分牙髓细 胞来源于神经嵴，并与神经细胞有共同特性：相同的膜电位，有对神经营养因子、生 长相关蛋白GAP-43、胶质酸纤维蛋白(glial acidic fibrillary protein)等与神经细胞 类似的应答反应。神经营养因子家族成员NGF被确认为积极参与牙髓神经发育和牙齿硬组织 形成过程。而GNDF是一种新发现的神经营养因子。
