牙周炎是一类以炎症诱导的牙槽骨吸收为主要特征的疾病，骨代谢平衡紊乱导致牙槽骨量减少，牙周支持组织破坏，出现牙周袋形成、牙松动、牙脱落等症状。在骨性疾病领域中，骨硬化蛋白成为关注焦点。骨硬化蛋白有抑制成骨的特性，骨硬化蛋白抗体有促进成骨的作用，分析骨硬化蛋白在牙周炎发生、发展中的意义，有可能为牙周炎发病机制和治疗的研究打开新思路。
1. 骨硬化蛋白调节骨代谢
1.1 骨硬化蛋白的发现
硬化性骨病又被称为骨硬化狭窄症（sclerosteosis），与van Buchem病一样是罕见的骨遗传性发育异常性疾病。这2种疾病都具有骨量过度增加的临床特征，具有相似的发病机制，硬化性骨病患者SOST基因位点突变，而van Buchem病患者SOST基因一部分片段缺失。SOST基因编码骨硬化蛋白，其突变可直接影响骨硬化蛋白的表达和功能。通过对这2种疾病的研究，发现骨硬化蛋白在骨代谢中具有关键作用。
1.2 骨硬化蛋白调节骨代谢
1.2.1 骨硬化蛋白抑制骨形成作用
骨硬化蛋白是一种糖蛋白，由SOST基因编码，主要由骨细胞分泌，含有1个胱氨酸结样结构，即与DAN蛋白家族相似。DAN蛋白家族具有拮抗骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）作用。骨硬化蛋白曾被认为是一种BMP的拮抗蛋白，但后期研究表明其作用机制不同于典型的BMP拮抗蛋白，通过抑制Wnt信号活性发挥功能。Wnt蛋白家族是一组细胞外蛋白质，可使Wnt信号相关的细胞表面受体活化。Wnt配体与其膜结合受体复合体结合后，细胞受到精密的转录控制，从而诱导或抑制特殊靶基因转录。
Wnt信号通路在骨改建、骨形成、骨质疏松症、骨折愈合中起到关键作用。Wnt/β-连环蛋白信号通路是一个主要的Wnt通路分支，在干细胞分化为成熟的、活化的成骨细胞过程中发挥作用，该通路活化时，成骨活动增加；通路受到抑制时，成骨作用减少。
当骨硬化蛋白和Dickkopf相关蛋白（Dickkopf-related protein，DKK）-1与Wnt受体蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白（low density lipoprotein receptor related protein，LRP）-5/6结合时，阻挡了Wnt相关蛋白与复合受体LRP-5/6和Frizzle复合体的结合，使Wnt信号通路不能被激活，接下来的转录过程受到阻碍。骨细胞分泌的骨硬化蛋白和DKK1通过作用于Wnt信号通路，抑制骨形成作用。此外，在Lin等的研究中，SOST基因敲除的小鼠具有更高的骨密度且其成骨明显增加。在另一项动物实验中，SOST基因过表达导致了小鼠骨量缺乏，而SOST基因缺失的小鼠骨量显著增多。
Ominsky等对猕猴注射3种不同剂量的人骨硬化蛋白单克隆抗体，2个月后，实验组猕猴骨密度升高且骨形成增加明显，骨质变化与注射的人骨硬化蛋白单克隆抗体剂量呈正相关。以上研究结论提示，SOST基因缺失导致成骨增加，而SOST基因过表达导致成骨减少。
1.2.2 骨硬化蛋白促进骨吸收作用
有学者提出骨硬化蛋白促进破骨细胞的的骨吸收作用。骨硬化蛋白可上调体外培养的人原代骨细胞或小鼠骨样细胞MLO-Y4内的核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）的mRNA水平，并减少骨保护素（osteoprotegerin，OPG）的生成，使RANKL/OPG比值上升，而RANKL/OPG比值增加对破骨细胞形成有促进作用。因此，骨硬化蛋白可能通过RANK/RANKL/OPG途径促进破骨细胞的生成并激活破骨细胞活性。
骨硬化蛋白还能刺激人骨细胞和小鼠骨样细胞MLO-Y4的碳酸酐酶2、组织蛋白酶K以及抗酒石酸酸性磷酸酶的表达，促进骨组织溶解。结果提示骨硬化蛋白可通过阻碍Wnt经典通路抑制成骨，还可能通过其他途径促进骨吸收。
2. 牙周组织中骨硬化蛋白的表达
2.1 非炎性状态下牙周组织内骨硬化蛋白的表达
近年来，有多篇文献证实在健康的牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质内有不同程度的骨硬化蛋白阳性表达。Napimoga等从牙周组织健康、无牙龈炎症、因美观需要进行牙龈成型术的人群中获取牙龈组织标本，使用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测标本中的骨硬化蛋白mRNA水平，使用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测标本内骨硬化蛋白水平，结果显示，无炎症的牙龈组织内可见骨硬化蛋白的表达。牙周膜细胞是牙周膜主要的细胞成分，具有骨分化潜力。
Lehnen等对小鼠磨牙牙周膜进行骨硬化蛋白免疫检测，发现4、8周小鼠牙周膜细胞有中等量骨硬化蛋白免疫阳性反应，新生小鼠和1、2周小鼠的牙周膜细胞骨硬化蛋白免疫反应为阴性。Jäger等在对离体的人牙周膜细胞进行矿化诱导1周时，发现了抗骨硬化蛋白抗体染色阳性的牙周膜细胞簇；矿化诱导3周，牙周膜细胞簇抗骨硬化蛋白抗体染色阳性反应更加强烈，与矿化前相比，牙周膜细胞内的骨硬化蛋白mRNA水平显著提高，牙周膜细胞钙化物持续增多。在矿化诱导作用前，只有单个牙周膜细胞有抗骨硬化蛋白抗体染色阳性反应。
林婷婷等的实验结果支持了Jäger等的结论，人牙周膜细胞矿化诱导14、21 d后，SOST mRNA水平明显上调，呈时间依赖性。研究提示，骨硬化蛋白参与了牙周膜矿化过程。骨细胞是合成骨硬化蛋白主要细胞来源，在牙周健康的牙槽骨陷窝内，可见骨硬化蛋白表达阳性的骨细胞，骨硬化蛋白染色的骨细胞数量较为稳定。Jäger等发现，在小鼠和人的牙槽骨中，只有骨细胞内有骨硬化蛋白阳性表达，成骨细胞和破骨细胞骨硬化蛋白染色为阴性。过去认为骨细胞是一种静止的细胞，但新近研究显示骨细胞分泌的骨硬化蛋白可能在穿过骨小管系统后，抑制成骨细胞活性，这提示骨细胞可能参与了骨代谢过程。牙骨质的再生或修复是牙周组织再生的必要条件，但牙骨质再生能力有限。
牙骨质分为细胞性牙骨质和非细胞性牙骨质，只有细胞性牙骨质在适当的时机可修复吸收的牙骨质。有文献证实，细胞性牙骨质的牙骨质细胞内有骨硬化蛋白表达，成牙骨质细胞和非细胞性牙骨质内都未发现骨硬化蛋白的表达。这一特点与牙槽骨相似，在牙槽骨中，骨硬化蛋白只见于骨细胞，在成骨细胞内未被发现。Lehnen等在小鼠牙骨质发育的研究中发现，只有4和8周的小鼠牙骨质细胞内有骨硬化蛋白的合成，而在新生小鼠以及1、2周小鼠牙骨质内未发现骨硬化蛋白表达。
牙骨质细胞分泌的骨硬化蛋白可能通过牙骨质小管和牙周膜内的毛细血管扩散到周围牙周组织内发挥功能，而骨硬化蛋白是否影响牙骨质自身的再生还需证实。牙骨质与牙槽骨有很多相似之处，骨细胞、牙骨质细胞和其小管系统有相似的形态学和生物学特征，但牙骨质无层状组织、无血管、无神经支配、无骨髓，目前没有文献明确证实牙骨质细胞具有骨细胞类似的功能，牙骨质细胞的未知功能还有待探索。
2.2 牙周炎对骨硬化蛋白的影响
2.2.1 牙周炎对牙周组织中骨硬化蛋白水平的影响
牙周组织发生炎性病变时，牙龈和牙槽骨中的骨硬化蛋白表达受到不同程度的影响，主要表现为骨硬化蛋白水平的升高。通过对牙龈组织的检验，Napimoga等发现，与牙周健康者相比，慢性牙周炎患者患牙周围的牙龈组织有明显较高的骨硬化蛋白水平和骨硬化蛋白mRNA水平。此外，在关于牙槽骨中骨硬化蛋白表达的研究中，Kim等发现牙周炎大鼠牙槽骨内骨硬化蛋白染色阳性骨细胞数明显多于非炎性牙槽骨。2014年，Kim等在6周Fischer-344大鼠下颌第一磨牙丝线结扎后的第1、3、10、20 d，对牙槽骨和类骨质进行组织学分析，发现实验早期，骨形成减少，骨硬化蛋白增多；实验后期，类骨质增多，骨硬化蛋白减少。该研究结果提示，牙槽骨细胞通过合成骨硬化蛋白参与了牙周炎的发病过程。
2015年，Kim等对牙周炎与骨硬化蛋白的关系进行了深入研究，发现在6周Fischer-344大鼠磨牙丝线结扎诱导牙周炎的第3 d，骨硬化蛋白染色阳性骨细胞数成倍增加，糖尿病牙周炎组和牙周炎组牙槽骨内骨硬化蛋白阳性骨细胞数比非牙周炎组高出1倍以上，但在结扎第20 d，牙周炎组骨细胞骨硬化蛋白阳性染色数量降低至对照组水平，而糖尿病牙周炎组骨硬化蛋白阳性数仍维持在较高水平。与此同时，研究者还对类骨质面积（osteoid area）进行计算，发现骨硬化蛋白与类骨质形成量有明显的相关性。骨硬化蛋白增加，类骨质形成明显减少，这与之前的研究结果相似，提示骨硬化蛋白在糖尿病合并牙周炎大鼠和非糖尿病牙周炎大鼠的发病过程中起到关键作用。
Balli等研究发现，慢性牙周炎患者龈沟液内骨硬化蛋白总量及浓度明显高于牙周健康人群，慢性牙周炎患者在牙周非手术治疗后，龈沟液骨硬化蛋白水平明显降低，龈沟液内骨硬化蛋白水平与附着丧失水平（clinical attachment level，CAL）、牙龈指数（gingival index，GI）呈高度正相关，龈沟液成分可反映局部牙周的健康和疾病状态。
2.2.2 牙周炎对全身血液中骨硬化蛋白水平的影响
牙周疾病与全身健康或疾病呈一种双向关系，互相影响。牙周炎状态下，不仅牙周组织骨硬化蛋白水平升高，血液内骨硬化蛋白也出现了相应改变。在Napimoga等的实验中，与牙周健康受试者相比，牙周炎受试者血清内骨硬化蛋白呈现明显较高的水平。Napimoga等提出，在牙周炎状态下，骨硬化蛋白不仅在牙周组织内发挥其生物学功能，还可能对全身系统起到一定的影响。但是，仅凭这一实验结果还不足以解释外周血内骨硬化蛋白水平升高与慢性牙周炎之间的相互关系和具体机制，需要多方面的实验设计来明确两者之间的关联。
3. 牙周炎影响骨硬化蛋白水平改变可能的机制分析
3.1 炎症因子影响骨硬化蛋白的合成
在牙周炎状态下，牙周组织内骨硬化蛋白水平升高可能与炎症状态下的牙周组织受到促炎症因子肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的诱导有关。全身健康但患有牙周炎的患者，患牙牙龈组织和血清内骨硬化蛋白水平明显较高；与此同时，牙龈组织内TNF-α mRNA也出现较高水平，血清内TNF-α的水平明显升高。Kim等发现，去势小鼠股骨中骨硬化蛋白染色较对照组更加明显；在应用雌二醇后，去势小鼠骨硬化蛋白染色减少。
研究结果表明，雌激素缺乏刺激了骨硬化蛋白表达；在应用雌激素治疗后，骨硬化蛋白水平得以恢复，TNF-α是调节雌激素缺乏引起的骨丧失的关键因子。为确定TNF-α与骨硬化蛋白的相关性，研究者对应用TNF-α阻滞剂和未应用TNF-α阻滞剂的去势小鼠股骨进行组织学免疫染色，结果显示，应用TNF-α阻滞剂的小鼠股骨内骨硬化蛋白的升高趋势受到抑制。研究者对裸鼠分别进行双侧卵巢切除术和假手术，而后用免疫组织化学染色来比较股骨中骨硬化蛋白表达情况，发现两组骨硬化蛋白表达并无显著差异，这是由于裸鼠基因突变引起胸腺退化或消失，导致T细胞大量减少，在雌激素缺乏状态下，活化的T细胞对于TNF-α的产生有重要作用。
Kim等表示，在雌激素缺乏状态下，T细胞来源的TNF-α可能通过上调肌细胞增强子因子2转录因子（myocyte enhancer factors 2 transcription factor）来刺激骨硬化蛋白的产生。有研究者发现，在肥胖性骨丧失的小鼠体内，骨细胞合成骨硬化蛋白增多，同时出现血清内TNF-α水平升高。在体外实验中，在使用TNF-α后，骨样细胞MLO-Y4合成了较多的骨硬化蛋白。
研究者认为，肥胖及其他炎性疾病导致TNF-α增多，通过NF-κB信号通路上调骨硬化蛋白，加速骨吸收。在牙周炎模型大鼠和糖尿病牙周炎模型大鼠的实验中，骨硬化蛋白水平明显上升，同时TNF-α增多，说明糖尿病牙周炎大鼠体内长期且广泛存在的TNF-α对骨硬化蛋白表达起到关键作用。综上，骨硬化蛋白的合成可能与TNF-α刺激密切相关。但是，TNF-α及其他炎症介质诱导牙槽骨骨细胞合成骨硬化蛋白的机制还有待深入研究。
3.2 咬合力影响骨硬化蛋白水平
机械刺激是影响骨代谢的因素之一，部分成骨细胞在分泌骨基质的同时，逐渐被骨基质包埋，嵌入细胞陷窝内，成骨细胞分化成了骨细胞，但仍保持与邻近细胞间的连接。这些复杂的连接细胞的网状结构使骨具有了修复能力，并可对机械刺激做出反应，没有机械负载的骨骼将出现骨细胞凋亡，由破骨细胞替代。骨细胞的机械感受功能很复杂，还未被完全阐明。骨细胞可能的感受器，包括主纤毛、细胞膜和树突等。非负荷条件下SOST基因缺失小鼠无骨丧失现象。长期卧床者血清内骨硬化蛋白水平、骨吸收标记物水平增高。
综上，机械刺激可能通过影响骨硬化蛋白水平调节骨改建。机械负载调控骨代谢的机制可通过骨硬化蛋白直接影响骨组织活动，也可能通过骨硬化蛋白的介导作用，改变RANKL/OPG，间接调节骨代谢。
在牙周炎状态下，牙周组织破坏可能导致牙槽骨受力异常，这种咬合力的改变可能会通过影响骨硬化蛋白水平，使成骨或破骨增加。适当的机械负载力对于牙槽骨极为重要，对牙周组织是一种功能刺激。没有力的刺激会导致骨代谢减缓，甚至牙槽骨吸收。但是，牙周组织受到过大的机械刺激，可能加速牙周炎的破坏过程。因此，骨硬化蛋白水平是否受到牙周炎状态下咬合力改变的影响，有待证据证实。
4. 骨硬化蛋白抗体应用于牙周炎治疗
牙周组织再生的方法已有很多，但牙周炎导致的大面积骨缺损再生还未解决，植骨和引导性骨再生类方法的骨再生能力还未能预测。SOST基因敲除或者使用骨硬化蛋白抗体可中和体内骨硬化蛋白，使鼠类的骨量和骨密度恢复，加速小鼠骨折愈合过程，临床试验证明，健康人群和绝经后女性在使用骨硬化蛋白单克隆抗体后，成骨标志物水平和骨密度有所提高。近年来，研究者对骨硬化蛋白抗体对牙周炎的治疗产生了浓厚的兴趣。
Taut等的结果显示，全身使用骨硬化蛋白抗体治疗后，大鼠的牙槽骨骨体积分数、组织骨密度表现出较高水平，牙周炎骨吸收状态得到逆转；局部使用骨硬化蛋白抗体治疗方式的骨再生效果较为有限。Kuchler等发现，骨硬化蛋白基因敲除的小鼠非细胞性牙骨质、细胞性牙骨质厚度增加，牙周膜宽度减小，下颌基骨厚度和体积增加为对照组的2倍，下颌牙槽骨厚度、体积明显增加，牙周组织学结构没有出现特殊变化，牙齿结构无明显异常改变。对去势牙周炎大鼠应用骨硬化蛋白抗体治疗，大鼠牙槽嵴顶水平、骨量增高，血清内骨钙蛋白和骨保护素含量增加，酸性磷酸酶和Ⅰ型胶原羧基端肽减少，提示骨硬化蛋白抗体通过增加骨形成和减少骨吸收来增加骨量。
牙槽骨合成来源于外骨膜、内骨膜及牙周膜，牙根邻近的牙槽骨形成主要来源于牙周膜内干细胞分化。骨膜蛋白在牙周膜内高表达，是牙周膜形成所需蛋白质，敲除编码骨膜蛋白的基因后，牙周膜内环境受到影响，牙周膜完整性受到破坏，出现类似牙周炎的表现。Ren等发现，敲除SOST基因的小鼠与敲除编码骨膜蛋白的基因的小鼠杂交，后代完全没有出现骨吸收；对敲除编码骨膜蛋白基因的小鼠早期（3个月）使用骨硬化蛋白抗体治疗，可阻止骨细胞形态的改变和牙周炎症状的出现；晚期（5个月）使用骨硬化蛋白抗体治疗，已吸收的牙槽骨密度及牙槽嵴顶高度升高，骨吸收陷窝减少。
SOST基因敲除和骨硬化蛋白的使用还使小鼠的牙周膜的组织形态得以恢复。值得一提的是，目前还没有其他可以使破坏的牙周膜结构得到恢复的手术或药物治疗方式。骨硬化蛋白抗体辅助治疗牙周炎确实具有巨大潜力，其增加骨密度和牙槽嵴高度、修复骨细胞形态和牙周膜形态的能力得到初步证实。
5. 结语
骨硬化蛋白不仅通过抑制Wnt信号通路抑制骨形成，还可能通过RANKL/OPG等途径促进骨吸收，在牙周病的发生、发展过程中起到关键调节作用，其具体机制有待深入研究。在牙周炎状态下，牙周组织及循环血液中骨硬化蛋白水平升高，体内骨硬化蛋白的检测有可能应用于牙周病的辅助诊断。骨硬化蛋白单克隆抗体促进牙槽骨成骨，有可能为牙周病提供有效的辅助治疗。
