微小RNA在牙周炎龈沟液中的表达差异及对牙周炎的调控机制

    牙周炎是目前全球人类最普遍的口腔疾病之一。近年来，世界卫生组织（World Health Organization，WHO） 强调了加强全世界牙周炎控制的重要性，WHO称牙周炎是导致全球慢性病负担的最重要口腔疾病之一，是一个重大的公共卫生问题。牙周炎的特征是深入牙周组织的炎症，最终导致支撑性结缔组织牙槽骨的丧失，是40岁以上成人牙齿脱落的主要原因。
    根据最新2018年牙周病和种植体周病新分类，相对于Ⅲ期和Ⅳ期牙周炎，Ⅰ期和Ⅱ期牙周炎的预后会有很大的改善，因为Ⅰ期和Ⅱ期牙周炎的邻间附着丧失小于5 mm，且没有因牙周炎而失牙。因此，快速准确地诊断牙周炎并对牙周炎进行积极有效的防治是当今的研究热点。
    在过去十余年中，人们已对牙周炎诊断的生物标志物投入了大量的研究，研究的目的就是制定一套客观和定量的牙周炎诊断标准，能够在牙周组织处于破坏性的炎症进展期时快速准确诊断。龈沟液微小RNA （microRNA，miRNA） 因其具有获取简便、操作无创、诊断定量的特点，成为近年来一个新兴的牙周诊断和治疗领域。本文就牙周炎龈沟液中miRNA的相关研究展开综述，旨在阐述miRNA在牙周炎龈沟液中的表达差异及对牙周炎的调控机制，为龈沟液miRNA准确诊断牙周炎提供理论参考。
    1. miRNA 与相关疾病的诊断
    Lee等在对秀丽隐杆线虫的研究中，报道了miRNA。miRNA的发现引起了生物医学研究领域的一场革命，如今更是延伸至临床领域。miRNA是一类由21~25个核苷酸组成的短链非编码RNA，在进化中高度保守，主要通过RNA沉默机制来调控真核生物的基因表达，对人类的正常发育至关重要，并广泛参与人体的生理过程，在几乎所有体液中都具有高度稳定性，但在疾病发生时miRNA的表达水平会发生相应改变。
    miRNA是人体对细菌病原体免疫和炎症反应的重要因子，体液中的miRNA参与了很多疾病的发病机制调控，可作为某些疾病潜在的诊断生物标志物。目前已有通过检测血液或尿液等体液中的miRNA对肺癌、肺结核、乳腺癌、肾癌等疾病进行辅助诊断的研究。另外，唾液中的miRNA也已被确认为口腔鳞状细胞癌的诊断生物标志物。而miRNA在牙周稳态和牙周炎进展中发挥着关键调节的作用，具有高特异性及高灵敏度的特点，因此对于牙周炎的诊断也具有重要意义；但目前还没有公认的利用miRNA的牙周炎诊断手段。
    2.龈沟液对牙周炎的诊断作用
    Brill等利用滤纸条在实验动物的龈沟中首次提取出液体，之后Chambers等对龈沟液中酶、炎性介质等宿主反应成分展开研究，但均未对龈沟液中成分的生理作用展开研究。直到后来，Socransky等确定了牙周炎的周期性，即牙周炎发展存在活跃期与静止期，牙周组织的炎症反应对牙周炎进展的有关键作用，越来越多的人才将目光放到了龈沟液成分诊断作用的研究。在健康的龈沟中，龈沟液的含量非常少，但随着牙周组织炎症程度的加重，龈沟液的含量会增加。
    龈沟液来源于牙周组织，是附着在牙齿表面的菌斑生物膜与牙周组织内细胞相互作用的结果，主要由血清和组织局部反应产物组成，如组织降解产物，炎性介质和针对牙菌斑细菌的抗体等。龈沟液是宿主的炎症渗出物，反映了产生龈沟液的牙周组织的炎症进展状态，因此龈沟液中的成分能作为牙周炎进展的潜在诊断或预后标志物，目前已有90多种不同的龈沟液成分被认为是牙周炎的诊断标志物。而且龈沟液的收集是一种无创且简单的临床过程，龈沟液中特定成分的分析还可以为评估患者牙周健康状况提供了一个定量生化指标。因此，龈沟液成分是近年来牙周炎诊断中最具前景的口内液体之一。
    3. miRNA 在牙周炎龈沟液中的表达差异
    miRNA在牙周疾病中的表达差异及作用已经被很多研究者提及过。多项研究表明，牙周炎患者牙龈组织中miRNA的表达水平与牙周健康者存在明显差异。Ghotloo等就通过实时荧光定量聚合酶链式反应分析牙龈组织中的miRNA，发现miR-146a的表达水平与牙周炎严重程度具有相关性。但龈沟液中miRNA表达水平的改变与牙周炎进展的关系仍不能确定。近年来，很多研究者开始对牙周炎患者的龈沟液进行实验研究，想要进一步确定牙周炎时龈沟液中某些特定miRNA表达水平的改变，拟确定理想的miRNA作为牙周炎诊断的生物标志物。
    Saito等检测了619个龈沟液中的miRNA，确认了40个miRNA在牙周炎组与对照组中存在差异表达，还发现miR-451a、miR-223-3p、miR-486-5p及miR-1260a、miR-203a、miR-210-3p和miR-205-3p表现出与先前牙龈组织研究中相似的上调和下调趋势。而miR-223-3是龈沟液样本中表达率最高的miRNA，在牙周炎龈沟液中表达上调，是牙周炎诊断中理想的龈沟液生物标志物，可以准确反映牙周组织的炎症状态。
    还有学者分别检测了龈沟液中miR-671、miR-122、miR-1306、miR-27a、miR-223、miR-1226 这6 种miRNA，只有miR-1226在牙周炎组和对照组之间存在显著差异，且miR-1226在牙周炎患者中表达下调。而Zhang等将牙周临床指标与龈沟液中miR-23a的表达水平相结合，发现龈沟液中miR-23a的表达水平与牙周炎检查指标呈正相关，即miR-23a表达水平与牙周炎炎症程度成正比。而经过非手术牙周治疗后，牙周炎的炎症程度减轻，龈沟液中的miR-23a表达水平也显著下降。
    牙周炎与多种全身系统性疾病相互影响，糖尿病就是牙周炎的明确风险因素，反映了人体氧化应激与牙周炎症之间的恶性循环，因此很多研究者将2型糖尿病与牙周炎合并研究。Elazazy等发现，miR-223和miR-200b在非糖尿病和2型糖尿病合并牙周炎患者的龈沟液中均会上调，且有糖尿病的患者miR-223的表达水平将进一步上调，而miR-203在该两组的龈沟液中下调。
    而有学者对miR-146a和miR-155进行研究，发现在非糖尿病和2型糖尿病合并牙周炎患者的龈沟液中，miR-146a和miR-155的表达水平明显上调，且糖尿病会进一步上调miR-146a，但经过非手术牙周治疗后，龈沟液中这两种miRNA的表达水平会显著下降。
近年来，牙周炎龈沟液中miRNA的研究中，最常进行研究的miRNA是miR-146a、miR-155、miR-203、miR-223和miR-200，而且大部分被研究的miRNA表达水平总体上调，miR-146a 和miR-223的表达水平改变最确定，并最可能作为疾病进展诊断的生物标志物。
    4. miRNA 在牙周炎中的调控机制
    牙周炎的进展主要是由于牙周组织周围的细菌产物和炎性因子引起牙周组织成骨与破骨活动的不平衡从而造成的牙槽骨逐渐丧失，其中涉及复杂的免疫级联反应，也伴随着巨大的细胞因子和趋化因子网络。促炎因子如白细胞介素（interleukin，IL） -1α、肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 等，以及调节细胞因子，如IL-4等在牙周炎进展过程中均会有所增加，进一步触发牙槽骨的成骨和破骨细胞活动，最终导致牙槽骨吸收。而在这一系列牙周炎的进展中，miRNA调控着先天免疫和适应性免疫的所有方面，控制免疫级联反应， 最终决定了牙周组织的状态。
    人体中miRNA与目的基因信使RNA的3’端非翻译区结合从而诱导目的基因沉默进而调控疾病的进展，miRNA的沉默机制已在多条生理和病理有关的信号通路中被发现。miRNA在牙周炎的进展中广泛存在，且调控多条牙周炎相关信号通路，发挥着不同的作用，但miRNA对牙周炎的具体调控机制仍未完全明确。
    学者们初步发现，口腔菌斑生物膜中的牙龈卟啉单胞菌，是牙周炎的重要致病菌，其细胞壁成分特别是脂多糖（lipopolysaccharide，LSP）在引发牙周炎症反应时发挥着重要的作用。Jiang等在研究miRNA与牙周炎进展时，发现miR-146a的表达水平增加，牙龈卟啉单胞菌LSP可以通过Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）信号通路，调节TLR2，TLR4和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），刺激宿主反应，引起牙周炎症反应，诱发牙周组织破坏。而miR-146a会阻断TLR信号通路的传递，作为牙周炎发病机制的负反馈调节。
    Moffatt等发现LSP刺激牙周组织后，miR-203被明显上调，从而调控下游的细胞因子信号抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS） 家族而控制核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor- κB ligand，RANKL） 信号通路影响牙周组织的成骨与破骨活动。
    Kajiya等也同样提出，LSP与破骨前细胞表达的TLR4结合后，可以为由RANKL介导的牙槽骨吸收提供共同刺激信号，从而通过肿瘤坏死因子受体相关因子6 （tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）、NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等因子引起下游信号通路传导，之后信号分子进入细胞核内启动基因转录，激活牙槽骨的免疫应答，释放炎性因子，从而进行牙周炎的牙槽骨改建。
    Elazazy等还发现miR-223和miR-200b在牙周炎发病机制中也具有潜在作用，具有诱导TNF-α分泌的能力。TNF-α主要由单核细胞和巨噬细胞分泌，是一种强大的炎症细胞因子，是牙周炎发病机制的主要细胞因子，可以调节胶原蛋白酶、前列腺素E2、趋化因子和细胞因子、细胞粘附分子和骨吸收相关因子的产生。而miR-203可能具有保护和阻止牙槽骨吸收的作用，因为其与TNF-α的水平呈负相关。
    综上所述，牙周组织炎症的引发依赖TLR信号通路。TLR是一种识别病原体的模式识别受体，可以与LSP结合刺激TLR信号通路，再通过髓样分化因子初次应答基因88 （myeloid differentiation factor 88，MYD88） 的募集和NF-κB在κ-轻链增强子上的结合来启动促炎途径。而miRNA作为基因修饰调节剂，已有不少miRNA被发现参与牙周炎进展的调节。
    miR-146a会阻断TLR信号通路的传递和随后的细胞因子反应，miR-203会调控RANKL介导牙周组织的免疫反应，引起牙槽骨改建。miR-223、miR-200b可以促进牙周组织炎症的炎性因子释放水平，而miR-203则会抑制。
    总之，牙周炎的进展由众多的miRNA共同调控，涉及不同进展阶段及多条信号通路。
    5.小结与展望
    目前，牙周炎的诊断仍然主要基于临床的常规检查，这些检查作为牙周炎的诊断指标不仅敏感性低，特异性差，而且还具有主观因素影响大和临床操作费力的缺陷。如今牙周炎已经越来越受到临床医生和普通民众的重视，对于它的诊断也需要不断的改进完善，以形成快速、敏感和特异性的诊断体系。
    确定牙周炎患者疾病进展阶段是良好治疗的基础，因此，寻找牙周炎进展时表达水平发生显著改变的生物标志物是目前牙周学领域的研究热点。目前的研究重点就是探索出牙周炎时龈沟液中显著改变及特异性高的miRNA，为牙周炎miRNA诊断的黄金指标提供理论支持。
    miRNA在牙周炎进展中形成了极其复杂的调控网络，研究者们对其机制的探索仍为冰山一角，具体的调控信号通路仍待进一步发现完善。未来，通过检测龈沟液中某些特定的miRNA对牙周炎进行准确诊断或将成为可能。