牙髓再生中血管网络重建策略

    牙髓炎是发生在牙髓组织内的炎症病变。牙髓腔是一个狭窄的空间，正常情况下只能通过狭小的根尖孔引流，发生炎症病变的牙髓往往难以自行痊愈，常导致牙髓坏死。目前牙髓炎的主要治疗手段为根管治疗，该方法虽然可以很好地控制感染与消除疼痛，但根管治疗是将病变牙髓组织去除，属于不可逆的治疗方法，无法恢复未成熟恒牙中受损牙髓的活力和促使其牙根成熟。
    治疗后会发生牙齿硬度减弱，必须通过牙冠修复来恢复牙齿的正常功能，难以满足现代口腔医学的要求。目前临床亟需寻求牙髓炎治疗的全新技术。再生医学治疗被认为是解决这一难题的可行的新方向。再生医学的基本原理是依靠生物正常生长时体内组织分化的特性，通过人工方法对创伤组织进行器官再生与功能重建，以达到修复损伤组织或重建器官功能的目的。
    再生医学的核心策略是通过人体内各种体细胞、干细胞或胚胎衍生细胞，分化出具有功能的细胞、组织或器官。早在2005年就有学者基于干细胞移植的再生医学方案对修复牙本质牙髓复合体展开探索，提出了利用牙髓干细胞进行牙髓再生的可能，为牙髓炎的治疗打开了一扇新的大门。
    现阶段牙髓再生仍面临着种种难题，其中之一是根管的特殊结构导致血管网络再生困难。牙髓再生在组织学上的关键标准在于牙髓充满血管、神经元形成以及牙本质的沉淀。其中牙髓血管快速重建是前提，组织内拥有大量血管网对细胞的代谢和清除破碎细胞有着十分重要的作用。
    有学者曾尝试直接将牙髓干细胞植入牙髓腔，但由于宿主的血管生成过缓，每天生长长度仅有0.1 μm，植入体因缺乏营养而未能存活。由此可见，牙髓再生的关键因素在于牙髓血管网络的重建。对牙髓再生中血管网络重建策略进行研究，对探索牙髓再生及其临床试验是十分必要的。
    目前血管网络形成主要依赖于两个基本的策略：一是体内原位血管生成，二是移植物预血管化。前者主要采用血管生成的思路，对残留牙髓或根尖周组织中的血管施加刺激，使残留血管重新构建出丰富的牙髓血管网络；后者主要采用血管形成的思路，在植入体中通过内皮细胞（endothelial cells，ECs）或各类能够分化成ECs的干细胞从无到有地分化出血管网络，随后植入于牙髓腔中。
    这两者并不是相互孤立的，原位血管生成技术由于生长速度过缓等一系列问题，催生了移植物预血管化技术；而预血管化技术中血管网络与根尖周组织血管快速的交通吻合，或是新生毛细血管在植入体中的血管生成，也需要有原位血管生成技术的参与。这要求研究血管网络形成策略必须充分考量两者之间的共通之处。本文就这两个基本策略的机制、作用和影响因素等进行系统总结和探讨。
    1.体内原位血管生成基本原理
    体内原位血管生成是指通过各种因素刺激ECs从血管表面生成血管芽从而形成血管网络的一种技术，既往已大规模开展相关实验，其机制研究地较为透彻。牙髓中血管生成的过程与全身其他组织中的过程大致相同，包含两个步骤：ECs在血管壁上形成血管新生芽（angiogenic sprouts），微血管的异位生长而导致的微血管分裂。
    血管新生芽是一种由ECs分化而来的特殊结构，包括了“尖端细胞”和“茎细胞”，其形成依赖于以下三个步骤：尖端细胞的选择分化、新生芽的延伸、血管腔的形成与扩张。对于血管新生芽而言，其延伸主要是“尖端细胞”的收缩过程，而不是“茎细胞”的延伸。
    血管腔形成的分子机制表现为依赖于ECs的细胞空化（cell hollowing）、线性空化（cord hollowing）、空泡形成（cavitation）以及质膜凹化（plasma membrane invagination）过程，其中质膜凹化被认为是一种新的管腔形成方式。
    微血管的异位生长为已有微血管在靠近相邻微血管的位置上的异位发芽，而不是在其一端的继续生长。对于牙髓组织而言，其所处环境的特殊性决定了影响牙髓原位血管生成的机制较其他组织有所差异。目前通过研究牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）与牙髓组织中ECs在血管生成中的作用，发现牙髓血管生成受到下列多种因素的影响。
    1.1 氧含量的影响
    氧含量是影响牙髓血管生成的一个重要因素。既往研究认为：缺氧能激活ECs糖酵解途径产生腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）直接激活增殖分裂以血管生成；但如今发现缺氧也可通过控制DPSCs的各种信号通路来影响。缺氧可以激活DPSCs中磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B （proteinkinase B，Akt）信号通路，使其线粒体产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的能力下降。
    过高浓度的ROS会损伤组织，只有较低而适宜浓度的ROS才可促进血管生成。Zhou等发现：缺氧促进DPSCs生成缺氧诱导因子-1α （hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α）与相扑-特异性蛋白酶1（SUMO-specific protease 1，SENP1），后两者又反过来促进DPSCs向ECs分化而形成正反馈回路。牙髓腔相比于其他组织属低氧环境，这要求牙髓原位血管生成技术必须充分考量缺氧这一刺激因素，而原属于牙髓腔的DPSCs在缺氧条件下的强血管生成能力会有所帮助。
    1.2 炎症反应
    炎症可增加细胞促血管生成信号因子的分泌。Gnanasegaran等发现：牙髓中炎症可致DPSCs的基因表达发生改变，使其表现出向肝细胞分化的趋势，可通过肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）/C-met途径参与到血管生成当中。炎症中牙髓组织内基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）-9、MMP-14的表达量明显增高，这些信号因子影响着血管生成。如何提高细胞在炎症中的生存能力也是一个需要考虑的重点。
    Bindal等还研究了人血小板裂解液（human platelet lysate，HPL）对DPSCs的影响，发现质量分数20%的HPL可以提高DPSCs在炎症环境下的生存能力与血管生成活性。此外，信号分子如HGF可以消除缺血组织的炎症和纤维化，有利于延缓缺血组织的坏死以便于及时血管生成。炎症的急慢性期均会对血管生成施加效应。
急性炎症期会提高血管渗透性，使血小板和免疫细胞到达附近。它们负责恢复正常的组织结构，为血管再生提供环境基础；而慢性炎症期这些细胞又分泌大量细胞因子维持着炎症反应，并且如上述阐述的机制进行血管生成。
    1.3 信号因子的作用
    无论是牙髓组织或是其他组织，ECs所受到的信号因子调控血管生成机制是相同的，可通过直接刺激、间接刺激或是反向抑制来调控血管生成。但牙髓组织中的细胞会以其特有的信号通路来调控这些信号因子的分泌，需要在牙髓血管重建策略中单独考量。刺激信号的研究最为透彻。能直接影响血管生成的信号因子中最重要的是血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），它可由DPSCs通过肾上腺素B2 （EphrinB2）/肾上腺素B4 （EphB4）、人信号素4D （Semaphorin 4D，Sema4D）/丛状蛋白B1 （PlexinB1） 等信号途径分泌。
    明胶酶（MMP-2和MMP-9） 通过成牙本质细胞分泌，通过切割细胞外基质促进血管生成。HGF能促进ECs的有丝分裂，其产生机制如炎症部分所述。能通过调控其他信号因子或细胞来间接影响血管生成的信号因子也起到了十分重要的作用。如成纤维细胞生长因子2 （fibroblast growth factor 2，FGF2） 能够刺激ECs产生MMPs和VEGF，同时能诱导牙祖细胞向成牙本质细胞分化。
    G补缀FHA域血管生成因子1 （angiogenic factor with Gand FHA domains 1， AGGF1） 通过核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB） 通路抑制炎症细胞因子，促进牙髓细胞（dental pulp cells，DPCs）的血管生成。
    MMPs中MMP-3可以释放位于细胞外基质/基底膜中的VEGF，VEGF是人牙髓成纤维细胞（human dental pulp fibroblasts，HDPFs）通过Wnt/β-catenin信号通路产生的。此外，抑制信号的作用不可忽略。
    对于MMPs 组织抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP）而言，处于牙髓炎状态时的DPCs能够分泌微小RNA（micro RNA，miRNA）-21，从而调节TIMP3与凝胶酶的相对水平。同时，炎症时高浓度的ROS也属于抑制信号，需要在血管生成过程中控制其生成。需要注意的是，这些信号因子的直接或间接作用以及正向或反向作用均不是绝对的，在血管生成的不同阶段、信号因子的数量以及靶细胞的不同均会影响其作用效果。对于这一复杂的信号通路网络仍需进行大量的研究。
    1.4 细胞外囊泡的影响
    相比于传统的激素或小分子物质所构成的信号因子，细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）作为一种新兴的信号传递介质，其在血管生成中的作用逐渐被揭示。EVs是一种囊性的细胞亚结构，含有多种核酸和表面受体。EVs在多种组织中的血管生成能力均得到了验证，可以认为EVs在牙髓组织中也参与了血管生成。一般来说，受损组织或血运丰富组织干细胞来源的EVs具有较强的血管生成能力。
    Zhou等发现：相比于牙周健康牙，从牙周受损牙中提取的DPSCs分泌的EVs有着更强的血管再生能力。来源于脂肪衍生干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs） 的EVs通过激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT） 和丝裂原活化蛋白激酶1 （mitogen-activated protein kinase1，ERK） 信号通路进行血管生成。
    这些EVs中常携带有miRNA，血管生成会受其影响。如胶质母细胞瘤中出现有一种含有miRNA的EVs，它能够有效地促进肿瘤微环境中的血管生成。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs） 也可以分泌富含有miRNA-210的EVs来改善梗死心脏中的血流状态。此外，目前EVs还作为口腔康复中无细胞再生医学的重要组成部分，将在后续内容（2.2.1部分）具体阐述。
    2.移植物预血管化技术
    体内原位血管生成虽然在体外或体内其他组织的实验中取得了较大的突破，但是在牙髓中的临床前实验面临着诸多困难：因为根尖孔的狭小与根管的狭长形态，体内血管难以长入植入的牙髓中，导致植入牙髓缺血坏死；而且体内原位血管生成是一段漫长的过程，在患者长期的治疗过程中必须保证足够的细胞因子与适宜的理化因素作用于植入牙髓中，目前的技术条件尚难以实现；此外，糖尿病等多种疾病会导致血管病变，也不利于体内原位血管生成技术的开展。因此，可利用移植物预血管化技术进行牙髓炎的治疗，以减少患者的不适感，并利于工业化快速生产，从而符合当代口腔医学的要求。
    移植物预血管化技术是指采用血管形成的思路，将原位组织或非原位组织的细胞在体外支架系统中培养出血管网络后植入体内。相比于传统的原位血管生成策略，预血管化技术有着临床操作快捷，容易大规模生产，对患者影响较轻等优点，在临床上有着较高的应用价值。
    2.1 预血管化技术的细胞来源
    2.1.1 ECs
    直接使用ECs用于血管生成是最简便的方法。目前ECs主要来源为脐静脉，通过酶消化可以从脐静脉中获取一定数量的ECs。此外，脂肪组织中也含有较丰富的微血管结构，通过消化等方式，可以从吸脂手术获得的脂肪组织中得到含有ECs的基质碎片。但是，无论是通过脐静脉还是脂肪组织的方式，从中获取的ECs数量均较少，获取过程较为困难，且在体外不能长期扩增传代，难以在体外大规模应用。除了直接通过DPSCs分化形成ECs外，利用体内其他更易获取或具有更强扩增能力的干细胞是较好的选择。以下几类细胞也表现出分化成ECs的能力。
    2.1.2 MSCs
    从骨髓中获取的MSCs被认为是用于大量扩增出ECs的重要细胞来源。利用VEGF、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growthfactor，bFGF）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）等细胞因子，现已能够在体外诱导MSCs向ECs分化，从而较大量地扩增出ECs，同时已证实了其用于预血管化技术的可行性。但是获取人自体骨髓这项技术难度较大，整项技术的成本较高，限制了其临床应用。
    2.1.3 脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）
脐带内细胞在再生医学中的大量应用证实：UC-MSCs具有分化成ECs的能力，能够用于血管生成。Liu等将UCMSCs植入于缺血性心脏病模型猪中，发现有部分UC-MSCs转变为ECs。Arutyunyan等发现：UCMSCs能在补充有VEGF-A-165的EA.hy926细胞条件培养基（培育EA.hy926细胞72 h后的培养基）中，表现出CD31内皮细胞表型。但目前看来，UC-MSCs转化成ECs的数量较少，能否在人工诱导下大量分化成ECs仍留有争议。目前临床应用仅停留于将其与ECs混合植入凝胶支架，而人工诱导其大量分化为ECs的方法仍待研究。
    2.1.4 脂肪基质血管组分（stromal vascular fraction，SVF）和ADSCs
    脂肪组织在人体内易于提取，同时其中有着大量具有血管生成能力的细胞，可能是预血管化技术潜在的细胞来源。SVF包括有ECs以及ADSCs、红细胞、淋巴细胞、周细胞等细胞，可以直接应用于血管再生，并已经在心肌、脊髓、皮肤等组织的血管再生中得到应用。
    已有实验证实：植入小鼠体内装有SVF的凝胶支架表现出大量血管生成，体现了SVF用于预血管化技术的可行性。此外，脂肪组织来源的间充质干细胞也具有向ECs分化的潜力。在通常的内皮细胞培养基中，ADSCs一般能够被诱导分化成ECs。
    培养基的构建可以在标准培养基中加入VEGF、bFGF、IGF、抗坏血酸2-磷酸盐（ascorbic acid 2-phosphat，A2P）、EGF与氢化可的松，也可以加入如人类皮肤微血管内皮细胞1 （human dermal microvascularendothelial cells-1，HMEC-1）等ECs所产生的分泌物。但Volz等建议去除培养基中的EGF和氢化可的松，认为它们会导致ADSCs的脱分化，可能会对ADSCs分化形成ECs产生不利影响。
    除了自身分化成ECs外，ADSCs能够激活内皮细胞微管基因，从而促进ECs的血管生成。Jin等认为ADSCs的功能与DPSCs高度相似，并认为使用ADSCs用于代替DPSCs的血管再生功能是可行的。他们发现DPSCs和ADSCs均能够表达MSCs相关的表面标记物CD29、CD44、CD105，都具有很强的促进血管生成活性，可以用于预血管化技术中。
    2.1.5 胎盘衍生的间充质干细胞（placenta-derived mesenchymal stem cells，PlaMSCs）
胎盘是一个高度血管化的结构，针对PlaMSCs用于血管生成的研究已有开展。在VEGF作用下，PlaMSCs能够表达内皮特异性标记冯·威利布兰德因子（endothelial-specific marker von Willebrand factor，vWF），提示分化成ECs。现已证实PlaMSCs不仅能进行体内血管生成，也具有体外血管生成的能力。相比于MSCs，PlaMSCs更加容易获取，因为胎盘通常作为废弃物被丢弃，对患者或胎儿无伤害，但获取时间与个体性别受限，同样可作为预血管化技术的潜在选择。
    2.2 预血管化系统的构建
    牙髓中预血管化系统的构建通常需要满足以下要求：构建丰富的血管网络，具有多孔结构的支架系统，建立适应的再生微环境，便于DPSCs的存活以及牙髓组织的形成。
    2.2.1 构建丰富的血管网络
    体外血管网络构建需要两个条件：一是需要有ECs以生成血管腔，二是适宜的周围环境激活ECs。当把ECs或细胞组分植入预血管化系统后，需要进一步建立适宜的微环境，但由于利用其他细胞来调控环境过于复杂，因此目前主要利用包括有特定信号因子的无细胞治疗剂与构建适宜的理化环境来诱导血管再生。用于促进血管生成的无细胞治疗剂通常分为组织提取物以及人工合成营养液两类。组织提取物中通常含有大量的信号因子。
    He等和Yu等分别以不同的方法提取出了人类脂肪组织液体提取物，证实其中含有大量bFGF、EGF、TGF-1、VEGF、HGF、脑源性神经营养因子（brain-derivedneurotrophic factor，BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）等促血管生成信号因子，被认为是一种优良的血管再生治疗剂。
    此外，多项研究也探讨了MSCs、人类脱落乳牙干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）分泌物对血管生成的作用，但人脂肪组织与人骨髓、脐带及脱落乳牙组织相比，从中获得自体细胞的量更大，减少了异体移植的风险，更符合现代口腔医学的要求。
    EVs可能是组织提取物中的重要成分，有学者考虑单独使用EVs的方案。大量获取EVs的方法主要是通过收集组织、MSCs、ADSCs及其他细胞的培养液，通过超速离心等方式来获得。从脂肪组织中衍生的EVs相比于骨髓组织，其促进人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）形成血管的能力更强。
    在EVs的临床前应用研究中，Zhou等设计了一种多肽纳米纤维水凝胶，在MMP-2存在时持续释放MSCEVs，并证实该凝胶能改善微血管ECs的再生。Zhang等将纤维蛋白凝胶与从DPSCs中提取出的EVs混合，获得了一种能够快速血管化的复合材料。人工合成营养液也被证实在体外血管生成中有着巨大作用。Seang等使用Iloprost （一种环前列腺素的替代物）成功让牙髓组织切片在无血清条件下存活接近3 d，并产生出新生血管。
    Ibrahim等发现：发酵初榨椰子油通过促进HUVEC、视网膜结节细胞5、成纤维细胞18等细胞的增殖，显著刺激了体外实验中的血管生成。此外也可以对EVs进行人工改造，如利用阿托伐他汀处理MSCs，改造后的EVs可以通过AKT/内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase， eNOS）通路增强ECs形成血管的功能。
    2.2.2 具有多孔结构的支架系统
    正常人的牙髓组织主要是由疏松结缔组织构成，这一疏松结构有利于各种纤维、神经、血管及淋巴管的长入。正如许多血管支架系统所提示的，支架的多孔结构是影响血管生成的一个重要因素，而水凝胶支架被认为是牙髓再生支架的首选。水凝胶是一类具有亲水性的凝胶的统称，具有较好的生物降解性，在牙髓恢复正常功能后其可被人体降解，是目前用于牙髓植入支架系统中十分有前景的选择。
    水凝胶分为天然凝胶与人工合成凝胶两类。天然凝胶采用体内成分构建，主要包括纤维素、胶原、明胶、透明质酸以及琼脂糖凝胶，其中如骨细胞外基质（bone extracellular matrix，bECM） 支架与牙髓牙本质复合体外基质支架具有足够强的促DPSCs分化能力，明胶支架也可人工封装如VEGF等信号因子以增强血管生成。
    人工合成凝胶既可以是完全人工合成的，也可以是通过改造天然凝胶获得的Ardeshirylajimi等总结了多种人工合成水凝胶支架，这些凝胶支架可用于增强细胞增殖、骨源分化、预防杀菌以及牙髓再生。对于改造天然凝胶，硼改性醋酸纤维素/氧化普鲁兰多糖/明胶凝胶支架实现了DPSCs的体外牙髓再生。
    水凝胶具有相互交联的结构，富含组织再生所需的孔隙。大孔径和高孔隙率的支架可以刺激大量胶原蛋白、血管和深部组织的生成，但孔隙的大小不是越大越好。Qazi等认为：302 μm左右的孔径刺激MSCs血管生成旁分泌的能力最高，这就对制造孔隙提出了技术要求。低温处理是一种常见的产生孔隙的方法，但是此方法难以控制其孔径大小。
    Dehli等设计了一种不使用低温、有毒化学品和有机溶剂处理的水凝胶支架，并且可以自行调控孔隙尺寸。另外，随着3D打印技术的发展，用于牙髓或基于DPSCs再生医学的3D打印技术凝胶支架也有众多学者开展，这为孔径大小控制提供了更多可选方案。
    除水凝胶外，诸如纳米粒子纤维技术、纳米光刻技术、重组蛋白技术等新型生物材料也已经开发出来。其中如涂有三氧化物多聚体（mineral trioxide aggregate，MTA） 的聚（L-丙交酯）[poly(L-lactide)，PLLA]纳米纤维增强了DPSCs的牙源性分化，石墨烯-聚丙酮混合纳米纤维实现了DPSCs的神经分化。但基于上述材料的牙髓植入临床前应用仍待研究。
    2.2.3 建立适宜的牙髓再生微环境
    由于所构建的预血管化系统将植入牙髓腔中并最终再生成人工牙髓，因此DPSCs必须能够在其中存活并最终分化成牙髓组织。这就要求预血管化系统有能促进DPSCs分化的要素以及对DPSCs无细胞毒性。DPSCs能够分化为成骨细胞、神经元细胞、血管内皮细胞、肌细胞和肝细胞等细胞，每种分化方向所需要的信号因子均不同。对于牙髓组织再生，自然希望其向着成骨细胞、神经元细胞及血管内皮细胞方向分化。
    另外，Duncan等的研究探讨了体外血管再生实验中生长因子（growth factor，GF） 的作用，认为GF的掺入有必要但现阶段技术难以实现。而有关对DPSCs细胞毒性的探究仍需大量的临床及临床前实验，期待后续的研究。
    2.3 牙髓血管网络构建的临床应用
    血管生成的临床应用较少，目前多停留在临床前实验阶段。多项研究均采用了细胞外基质及其衍生物作为凝胶支架，加入DPSCs/ADSCs/人骨髓中层间充质干细胞与细胞因子，植入人离体牙根管中，随后接种于动物体内，均获得了较好的牙髓再生情况。
    目前基于DPSCs/SVF的牙髓血管再生思路被认为是从安全性与效果上都符合要求的方法。DPSCs起源于牙髓组织中，分化成牙髓组织的可行性高；SVF携带有大量信号因子，可从自体器官中大量获取，具有更好的安全性，其中的ADSCs具有强血管生成能力。此外，Lin等的研究证实：DPSCs可以显著减少受损牙周组织的再生周期，提示基于DPSCs的牙髓再生临床应用可能会获得比其他细胞更好的疗效。而采用移植物预血管化技术的实验则较少，Athirasala等设计了一种带有中央通道的水凝胶支架，利用成牙本质细胞样细胞培养得到的新生血管会从通道处向外发散。
    尽管目前的研究已经取得了一定进展，但是正如Huang等所担忧的，将凝胶支架植入根管中这一过程，正是该治疗技术中最为困难的一点。每个人根管的形状、大小、结构均不固定，易碎的凝胶支架植入过程中需要高分辨率CT进行辅助，从而使得这项技术无法大规模开展。
    此外，植入框架属于外来异物，血管支架植入会不可避免地引发不良炎症反应。迄今尚未发现有培养出完整血管网络支架的牙髓预血管化实验，由此推测其困境和上述根管植入技术不成熟有关，期待后续研究。
    3.结论与展望
    自从Nakashima等于2005年提出通过再生医学治疗牙髓炎的方法后，众多学者对此问题进行了不断地研究，提出了各种各样的再生修复方案。随着研究的深入，牙髓血供不足的问题逐渐浮现，学者们提出了体内原位血管生成和预血管化系统植入两种方案，探究出两者的机制与影响因素，并逐步开展各项试验，为牙髓再生的临床治疗奠定了基础。
    原位血管生成技术虽然治疗疗程长，受体内环境影响大，需要考虑其他细胞的影响，临床实验成功率相对较低，但在新生血管网络和残留组织血管网络之间起到了桥梁作用，在血管生成策略中仍需重点看待。预血管化技术存在可缩短治疗疗程，可采用其他细胞以减少成本或减少不良反应，可采用无细胞培养液以减少不良影响，利于工业化生产等优点。
    基于DPSCs、SVF/ADSCs、水凝胶血管支架的血管再生策略相比于其他策略，具有细胞获取来源广、组织相容性好、血管生成能力强、血管再生机制较为透彻以及凝胶支架孔隙构建简单等优点，可为进一步的临床应用奠定基础。目前对于牙髓再生的临床实验依旧不足，难以降低支架植入根管难度与解决不良炎症反应的影响，多停留在体外实验和动物实验上，且少有预血管化技术的临床应用研究。
    此外，对于细胞移植可能带来的细胞毒性和安全性问题，虽然在大多数既往研究中尚未发现明确的不良反应，但需要注意的一点是，目前推荐使用自体细胞来进行预血管化技术，因为异体细胞可能会引起免疫反应等异常反应，而且体外培养扩增获得的细胞需要经过严格的安全性和有效性检测才能应用于临床，所以仍需对此项技术保持谨慎态度。希望今后能够尽早进入临床实验。
    综上，基于DPSCs、SVF/ADSCs、水凝胶三者结合构建出的移植物预血管化系统可能是未来的重点研究方向，但对于如何降低植入难度、系统血管网络构建情况、组织相容性、长期观察下的各种理化和毒理性质仍需进行大量研究。在该领域进行的深入探索和临床研究，有望为患者的牙髓炎治疗提供新的方向。