腺苷酸活化蛋白激酶在牙周病发生发展中的研究进展

    腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）是一种广泛存在于真核细胞中的蛋白激酶，通过调控脂肪酸和葡萄糖的代谢维持细胞能量的稳态，被称为“细胞能量调节器”。在慢性代谢性疾病，如2型糖尿病、高血脂以及炎症疾病如动脉粥样硬化中，AMPK已经得到广泛研究。
    牙周病是由特殊致病菌和破坏性免疫反应相互作用导致的牙周支持组织发生病理性吸收所致。牙周炎的多种刺激因素通过打破成骨和破骨过程的平衡以抑制牙槽骨的修复性改建，通过促进细胞基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs） 的分泌降解细胞外基质，通过调控牙周组织细胞的自噬促进牙周病的发生以及发展。多种效应分子可以通过AMPK信号通路调节牙周组织的骨代谢、MMPs分泌、免疫反应以及自噬，进而揭示出AMPK与牙周病存在相关性。本文对AMPK及其在牙周病发病机制中的研究进展作一综述。
    1. AMPK的来源及其结构特点
    AMPK在真核细胞中广泛存在。1979年Beg等在大鼠肝脏细胞中发现了AMPK，随后Munday等将其从大鼠肝脏中分离纯化并命名。AMPK是一种三聚体蛋白复合物，包含激活中心α亚基（α1、α2）及2个调控亚基β （β1、β2） 和γ（γ1、γ2、γ3）。
    α亚基（α1、α2亚基在人体内分别由PRKAA1、PRKAA2基因编码）中存在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活化结构域和自我抑制结构域，其上游的蛋白激酶可以通过磷酸化α亚基中的苏氨酸172 位点（threonine 172， Thr172）激活AMPK，同样AMPK结构中的调节亚基β、γ也可以作用于α亚基的调节结构域，调控AMPK的活性。
    β亚基（β1亚基在人体内由PARAB1基因编码）中含有糖原、碳水化合物结合结构域，可以通过感受细胞中的糖原和碳水化合物的含量调节AMPK的活性。γ亚基中的AMP/ATP/ADP结合位点也可以通过感受细胞中腺苷酸的含量调控AMPK活性。有研究发现一些中药及其相关成分如白芦藜醇、黄连解毒颗粒等可以通过调控AMPK信号通路参与牙周病的调控。
    2. AMPK 参与调节牙周骨代谢
    2.1 参与调节破骨细胞的分化
    牙槽骨丧失是牙周病进展的标志，破骨细胞是牙槽骨丧失过程中重要的骨吸收细胞，因此抑制牙槽骨破骨细胞的分化是预防牙槽骨丧失的关键。有研究表明：AMPK的表达及活性的提高可以抑制核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）及其下游基因核因子κB （nuclear factor kappa B，NF- κB） 的表达， 从而抑制牙周破骨细胞的分化。
    在体内实验中，白芦藜醇、低浓度二甲双胍（50 mg·kg-1）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)n，PLGA]为载体的盐酸二甲双胍粒子均可以通过提高小鼠牙龈组织内p-AMPK和AMPK的含量，增强AMPK的活化及其基因的表达，下调RANKL以及其下游NF-κB基因的表达，进而抑制糖尿病模型小鼠牙槽骨的破骨吸收。
    相反， 脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）、高浓度二甲双胍（100、200 mg·kg-1） 则可以降低小鼠牙周组织p-AMPK的含量，抑制AMPK的活性，促进RANKL基因表达，进而促进小鼠牙槽骨吸收。在体外实验中，高糖环境（5.5~35 μmol·L-1）和乙醇均可以降低细胞p-AMPK含量，抑制AMPK的活性，进而促进RANKL及其下游NF-κB基因的表达，诱导人牙周膜成纤维细胞向破骨细胞分化。
    相反褪黑素和二甲双胍（200、500 μmol·L-1） 则可以通过提高细胞内p-AMPK和AMPK 的含量，促进AMPK的活化及AMPK基因的表达，改变乙醇和高糖环境（5.5~35 μmol·L-1） 对AMPK活性的抑制作用，抑制后者对RANKL基因表达的促进作用，从而抑制人牙周膜成纤维细胞向破骨细胞分化。
    同样，β-拉帕醌（β-lapachone）、尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，uPA） 及其衍生多肽A6也可以通过提高细胞中p-AMPK含量，活化AMPK，抑制RANKL基因的表达，抑制小鼠骨髓细胞向破骨细胞分化。
    2.2 参与调节成骨细胞和成牙骨质细胞的分化
    牙槽骨及牙骨质的再生是牙周病治疗和预后的关键。相关研究表明：上调AMPK的表达和蛋白活性均可以上调Runt相关转录因子2 （runt related transcription factor 2，RUNX2） 基因的表达，促进成骨细胞分化。在体内实验中，激光治疗（450 nm 蓝光） 可以通过提高细胞中p-AMPK的含量促进AMPK活化，上调RUNX2基因的表达，促进比格犬牙槽骨的成骨分化。在体外实验中，二甲双胍也可以通过肝脏激酶B1 （liver kinase B1，LKB1） /AMPK信号通路提高细胞中p-AMPK的含量，激活AMPK，促进RUNX2基因的表达，使人多功能干细胞诱导分化的骨髓间充质细胞向成骨细胞分化。
    白芦藜醇、沉默信息调节因子2同源蛋白1 （silent mating typein formation regulation 2 homolog 1， SIRT1/sirtuin1）、三磷酸钠和六磷酸钠，可以上调人牙周膜成纤维细胞中AMPK、p-AMPKα 的表达量，增强AMPK的表达及活化，提高RUNX2基因的表达，进而促进人牙周膜成纤维细胞向成骨细胞分化。
    笔者所在课题组也证实：辛伐他汀可以通过提高AMPK在人牙周膜成纤维细胞中的表达，促进人牙周膜成纤维细胞向成骨细胞分化。相反， 肽基脯氨酰顺/ 异构酶NIMA互作蛋白1（peptidyl-prolyl cis-trans isomerases, NIMA-interacting1，PIN1）、小窝蛋白1 （caveolin 1， CAV1）均可以通过减少小鼠牙周膜成纤维细胞p-AMPK、AMPK的含量，降低AMPK的活性以及基因的表达，进而抑制小鼠牙周膜成纤维细胞向成骨细胞分化。
    经成骨诱导的人牙周膜成纤维细胞分泌的外泌体也可以通过提高细胞中p-AMPK的含量，活化AMPK，上调RUNX2基因的表达，促进鼠骨髓干细胞向成骨细胞分化。除此之外，激活AMPK还可以抑制细胞向成牙骨质细胞分化。Huang等报道：SIRT6 通过提高小鼠永生化成牙骨质细胞系OCCM-30细胞内p-AMPKα的含量，促进AMPK的活化，抑制葡萄糖转运体1 （glucose transporters 1，GLUT1)基因的表达，抑制牙骨质形成。
    3. AMPK 参与调节MMPs的分泌
    MMPs的过度分泌是牙周组织的细胞外基质和基底膜病理性破坏的主要原因。据报道：在体外上调AMPK基因的表达和活性可以抑制细胞MMPs的分泌。研究表明：京尼平（genipin）可以通过细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK） /AMPK信号通路上调细胞中p-AMPK的含量，提高AMPK的活性，抑制人牙周膜成纤维细胞MMP-1、MMP-3的分泌。
    相反，Compound C和肿瘤坏死因子α （tumor necrosis factor-alpha，TNF-α） 则可以通过降低细胞p-AMPK的含量，减弱AMPK的活性，改变京尼平对细胞MMP-1、MMP-3分泌的抑制作用。同样，Yu等也证明了Compound C和牙髓卟啉单胞菌（Porphyromonas endodontalis，P. endodontalis） 的LPS 可以通过下调细胞p-AMPK的含量，减弱AMPK的活性，进而促进小鼠成骨细胞MMP-2的分泌。
    随后其团队又在另一项研究中证明：白芦藜醇可以通过提高小鼠成骨细胞MC3T3-E1中p-AMPKα的含量，激活AMPK，抑制Compound C和P. endodontalis LPS对小鼠成骨细胞MMP-2分泌的促进作用。
    4. AMPK 参与调节牙周的免疫反应
    牙周病的致病因素通过调控宿主保护性或破坏性的免疫反应，进而促进牙周病的发生和发展。体内研究报道：AMPK的表达及活性的改变可以调控牙周组织的炎症反应。临床研究证明：在牙周炎患者的外周血液中，p-AMPK和促炎因子白细胞介素（interleukin，IL）-1β含量均升高，即AMPK活性与牙周组织的炎症反应存在相关性。
    同样也有在动物体内的相关研究报道，如白芦藜醇可以通过上调小鼠牙龈组织中p-AMPK的含量，提高AMPK的活性；但Zhang等却认为，黄连解毒颗粒可以通过减少牙周组织内p-AMPK的含量，降低AMPK的活性，二者均可以抑制小鼠牙周组织细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS） 的含量，减少牙周细胞的氧化应激以及炎症介质的分泌。
    除此之外，笔者所在课题组也通过敲除小鼠AMPK- α基因的研究发现：AMPK基因的表达可以促进固有淋巴细胞，尤其是第二亚类的固有淋巴细胞在小鼠牙周组织的浸润，减少炎症细胞因子IL-33的分泌，调节牙周组织的免疫反应。在体外实验中，上调AMPK的表达和活性可以抑制细胞炎症反应。据报道：何首乌提取物2,3,5,4’- 四羟基二苯乙烯-2-O- β-葡萄糖苷（2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene -2-O-beta-glucoside，THGS）、CD73依赖的腺苷酸均可以上调人牙龈成纤维细胞中AMPK、p-AMPK的含量，促进AMPK的表达和活化，减少细胞炎症介质的分泌，抑制细胞的炎症反应。
    乙酸乌药脂同样也可以提高细胞p-AMPK、AMPK的含量，促进AMPK的活化并延长其活化时间，减少人牙周膜成纤维细胞炎症介质的分泌。笔者所在课题组也证明：辛伐他汀也可以提高人牙周膜成纤维细胞AMPK的表达及活化，通过AMPK/MAPK/NF-κB信号通路，抑制细胞炎症介质IL-1和TNF-α的分泌。
    相反，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）LPS通过降低人牙龈成纤维细胞和牙周膜成纤维细胞中p-AMPK的含量，减弱AMPK活性，增强细胞炎症反应。
    5. AMPK 参与调节细胞自噬
    自噬可以通过调控细胞的内质网应激，影响细菌在细胞内的定植、存活，并与牙周炎症反应相互作用，从而参与牙周组织的破坏和改建，对于牙周病的发展进程有重要作用。有研究证实：上调AMPK的表达及活性可以提高微管相关蛋白1轻链3 （microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3） 的含量，进而促进细胞自噬。例如白芦藜醇和成骨诱导因子（地塞米松、β-甘油磷酸酯、抗坏血酸） 协同作用、P. endodontalis LPS可以分别使人牙龈间充质干细胞和龈沟上皮细胞中p-AMPK以及AMPK的含量上升，提高AMPK的活性和基因表达以及LC3的含量，促进细胞自噬。
    在饥饿状态下，丁酸盐可以通过提高人牙龈上皮细胞中p-AMPK的含量，激活本应被抑制的AMPK，提高LC3蛋白的含量，使细胞由于过度自噬而凋亡。相反，Yang等证明：在多巴胺羟磷灰石培育的牙周膜成纤维干细胞中，二甲双胍可以通过提高p-AMPK的含量活化AMPK，提高细胞LC3的含量促，进细胞自噬，进而提高细胞的活性。
    6.小结与展望
    综上所述，AMPK在体内或体外均已证明可以参与牙周病的进程。总结来说，AMPK可以通过以下4点参与牙周病进程的调控：1） 参与牙周骨代谢的调节，即成骨和破骨细胞的分化；2） 参与MMPs分泌的调节；3） 参与牙周免疫的调节；4） 参与细胞自噬的调节。这也揭示了AMPK在牙周病的治疗中具有潜在作用，为牙周病的治疗提供了新的治疗策略。
    一些中药可以通过调节AMPK的表达及活性参与其他疾病的治疗，如小檗碱可以抑制巨细胞激活导致的治疗后动脉粥样硬化再狭窄，姜黄素可以治疗骨质疏松症，白芦藜醇可以治疗急性脊髓损伤导致的神经炎等。由此笔者推测：中药的天然化合物也可能通过调节AMPK的表达及活性来预防和控制牙周病的发生和发展；但目前为止AMPK在牙周组织细胞中的分子作用机制仍不明确，相关药物的开发也需进一步的基础和临床研究。