牙髓血运重建术后根管内矿化组织形成的研究进展

    年轻恒牙是指刚萌出到口腔，形态、结构尚未完全成熟的恒牙。年轻恒牙在发育过程中常因龋病或外伤等因素导致牙髓感染或坏死，进而出现根尖发育停止的现象。喇叭口样宽大的根尖若用常规根管治疗的方式直接充填，易引发超充、充填不密、根折等问题。
    牙髓血运重建术（dental pulp revascularization）多以血凝块为支架，诱导年轻恒牙的残余牙髓细胞、根尖周干细胞在根管壁表面形成矿化组织，起到增厚根管壁、封闭根尖孔的作用。早在上个世纪60年代，就有学者提出利用根管内血凝块修复根管组织的策略。
    2001年，Iwaya等首次提出牙髓血运重建术这一概念，通过灭菌药物灌洗代替机械清洁根管，保留年轻恒牙根尖存活牙髓以促进根管内组织再生。2004年，Banchs等正式制定牙髓血运重建技术操作流程，后人不断对其加以修改与完善，2013年美国牙髓病协会（American Association of Endodontics，AAE）发布了完整的牙髓血运重建术的操作指南。早期的临床研究通过X线片验证了牙髓血运重建术后部分患牙可出现牙根增长、根管壁增厚的现象。最初，学者们推测根管内新形成的硬组织来源于根尖区残留的未感染牙髓组织，Herwig's上皮根鞘（Hertwig＇s epithelial root sheath，HERS）细胞和根尖周干细胞也可能与牙髓血运重建术后牙根形成有关。
    随着组织学和免疫组化技术的应用，动物实验显示牙髓血运重建术后大多数根管的根尖部分被新形成的矿化组织不严密填充，矿化组织内可见含有血管与成纤维细胞的活性结缔组织。2015年，第1例来自人类年轻恒牙的牙髓血运重建术的研究显示，术后根管内矿化组织为牙骨质样或骨样组织，而未见牙本质结构。
    牙髓血运重建术后根管内矿化组织的质量和数量与其预后效果密切相关。本文将对近年来牙髓血运重建术后根管内矿化组织相关的基础和临床研究进展进行综述，就其可能机制及影响因素进行探讨，并提出可促进牙髓血运重建术后根管壁矿化组织形成的策略。
    1.牙髓血运重建术后根管内矿化组织的形态和种类
    牙髓血运重建术后根管内矿化组织形态多样，Song等将其大致分为钙化屏障（calcific barrier，CB）和根管闭塞（canal obliteration，CO）两大类，认为观察时点不同是造成观察到根管内矿化组织形态不同的原因，根管内矿化物质在前期形成钙化屏障或散在钙化，随着矿化组织不断沉积，最终表现为完全闭塞，但并未有足够长期的观察实验证实这一点，也并未有相关文献明确表述各种矿化组织形成的准确时间。根管内新生矿化组织根据形成机制可分为修复性牙本质、类牙骨质组织、类骨组织、根尖周硬组织长入等，其形成机制与其形态有一定关联。
    1.1修复性牙本质
    年轻恒牙的根尖孔宽大，即使根尖周感染也可能留存活髓组织。因此，牙髓血运重建术时常避免对根管进行机械预备，以尽量保留根尖的活髓组织。动物实验显示，当根尖存在1～4mm无感染牙髓时，牙髓－牙本质复合体可再生。新形成的牙本质小管结构排列紊乱，呈现出修复性牙本质特征。
    Herwig's上皮根鞘细胞存活时能促进牙根发育，但易受炎症影响。在HERS细胞与根尖乳头受损伤程度较小的情况下，根部的成牙本质细胞可形成根牙本质，牙根能继续增长。
    1.2类牙骨质组织
    张映娟等对犬无髓年轻恒牙的牙髓血运重建术研究发现，牙骨质在其根管外表面沉积，延续生长到牙根内表面，称之为根管内牙骨质（in-canal cementum，IC）。术后3个月所有患牙内壁均出现牙骨质样硬组织沉积，根管壁增厚及牙根长度增加。
    除根尖周的牙骨质可直接长入根管之外，当用K锉刺破根尖周组织，将血引入根管内时，根尖周组织内的干细胞，可分化为类牙骨质细胞，形成沉积于根管内壁表面的类牙骨质组织，称为牙本质相连矿化组织（dentin-associated mineralized tissue，DAMT）。DAMT为类牙骨质结构但胶原幼稚结构无序，基质内几乎无细胞。根中部牙本质表面的DAMT与牙本质壁之间结合不是特别紧密，可见部分分离，但在某些牙本质脱矿区域可见胶原纤维将两者紧密相连。
    随着时间的推移，DAMT会持续沉积直到完全封闭根管。在长期根尖周感染的状况下，根尖乳头无法存活，HERS细胞在后期改变其形态，向间充质细胞转化，分化为类成牙骨质细胞，此时牙根长度的增加与牙骨质样结构沉积有关。
    1.3类骨组织
    根管中血凝块内的干细胞分化为类成骨细胞时，会形成类骨组织，这些类骨组织未与根管内壁接触，称为骨岛（bony island，BI）。BI为类牙槽骨结构，基质内含大量细胞、血管、骨髓样组织但缺乏骨单位，有免疫组化分析显示，BI表达破骨细胞特征性酶——抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP），提示BI除沉积外还同时发生骨改建。Lei等对人年轻恒牙的组织学研究显示，类骨组织与类成骨细胞形成的矿化组织岛可出现在根管中段。
    BI与DAMT间存在一定关联，BI与牙本质壁不接触，与DAMT之间由疏松结缔组织连接，在某些区域也呈现出紧密绞索连接，但BI与DAMT是否最终会完全融合尚需要更多长期实验证实。牙髓血运重建术后根管内的主要矿化组织为类牙骨质组织与类骨组织，提示术后根管内微环境更有利于牙周膜间充质干细胞分化增殖。
    1.4根尖周硬组织直接长入
    当根尖孔无法正常闭合时，根尖区可产生形态不规则被结缔组织包裹的钙化团块，内嵌针状牙本质、较多的成纤维细胞和炎性细胞，阻碍根尖孔的闭合。长入根管内的结缔组织发生改建或牙槽骨与根管内硬组织之间形成连接时，根管内外硬组织出现相连。
    2.影响牙髓血运重建术后矿化组织形成的因素
    2.1根管内是否有牙髓再生
    根管内是否存在能发挥生理功能的牙髓决定了新生矿化组织的性质，牙髓的原位再生并恢复其生理功能，是牙髓血运重建最理想的结果。早期研究者在术后观察到患牙牙髓活力测试阳性，但仅以此推测牙髓再生的成功并不严谨。
    引起牙髓电活力测试阳性的其他可能原因是：①残余活力牙髓；②干细胞如牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）、牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分化为神经元细胞。只使用X线片与牙髓电活力测试难以评价牙髓血运重建术后的矿化组织是否为牙本质以及是否有牙髓再生。目前，有学者在活性生物材料与干细胞方面研究，致力于创造适宜微环境促使干细胞向成牙本质细胞定向分化，并有实验观察到牙髓样结缔组织形成，但其结构与功能尚待进一步研究。
    2.2根管感染程度
    根管感染严重程度会影响根管内矿化组织沉积性质和形态。根管内感染消除不彻底的患牙，根管内炎性细胞常与新生牙骨质样组织并存，坏死细胞残片与牙本质碎片嵌入其中，周围包绕新生结缔组织。另外，与无感染组相比，感染组新生牙骨质的量更少。Stambolsky等对犬牙的组织学研究表明当感染极严重或极轻微时，形成矿化物的概率较低。
    严重感染可能会影响根尖周干细胞生存的微环境，同时影响引血后血凝块发挥正常支架作用，造成血运重建的失败；当使用高浓度抗生素对根管进行化学清理，会同时产生细胞毒性作用，导致矿化组织形成减少。牙髓血运重建术的临床病例显示，失败病例多与持续感染相关。刘彩霞等报道了10例年轻恒牙牙髓血运重建术后病例，所有患牙都有不同程度根管壁的增厚，但有部分感染较重的根尖周炎患牙根尖孔未闭合。
    2.3根管内生物支架
    2.3.1血凝块
    根管内血凝块通常来源于根尖周组织，在牙髓血运重建中起到重要作用：第一，血凝块内的胶原起到支架作用，可为干细胞的增殖分化提供空间。第二，血凝块的引入更容易将根尖周细胞带入根管，作为成牙骨质细胞与成骨细胞的前体细胞来源。第三，血凝块中的血小板存储和分泌活性生长因子、多种细胞黏附分子，均有利于根管内矿化组织沉积。
    2.3.2血制品支架
    富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP），是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物，可形成三维纤维网络，比普通血凝块富含更高浓度生长因子，是一种高效的支架。Alagl等研究显示使用PRP支架可显著增加根长。近年来还有第3代血小板浓缩制品，浓缩生长因子纤维蛋白（concentrated growth factors，CGF），以CGF产品作为干细胞增殖和分化的支架，有利于提高牙髓再生的成功率。
    2.3.3人工合成支架
    随着应用于口腔医学领域生物材料的飞速发展，各种人工合成材料，如纳米纤维、纤维蛋白凝胶也被用于牙髓血运重建术研究中。人造交联胶原支架使用纯化的Ⅰ型胶原，形成不可溶的胶原网络，提供稳定的微环境，更有利于干细胞的黏附和生长。有实验表明，使用交联胶原支架比仅使用血凝块能更显著提高根管内矿化组织沉积程度。商品化胶原蛋白膜的使用可促进患牙根中1/3的牙本质壁的发育。
    磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）是一种具有生物学活性的新型非陶瓷型羟基磷灰石类人工骨材料，具有“骨引导性”和可降解性，且封闭根尖完全，抗菌抑菌效果好，炎症下仍可诱导根尖孔闭合。人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）和人成骨细胞（human osteoblast，HOB）共培养方法成功地在CPC+RGD序列（由精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸组成）上生成了微毛细管样网络。新型胶原蛋白－羟基磷灰石支架的使用诱导新矿化组织形成，在原牙本质表面形成类牙骨质组织。这类磷酸钙支架常以矿化物质充满根管从而提高牙根机械强度为最终目标。
    2.3.4与干细胞结合支架
    牙髓血运重建术的成功与否离不开干细胞、生长因子、支架这三大要素。众多研究致力于再生具有形成牙本质功能的牙髓组织，常用干细胞有人脱落乳牙干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）、PDLSCs、DPSCs、骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）等。有学者将人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）与纳米生物玻璃涂层牙本质于裸鼠体内培养，观察到牙本质表面的细胞黏附和牙源性分化。
    目前认为干细胞参与组织的再生与修复；生长因子促进干细胞的增殖与分化；支架作为一种三维结构的支持物，可供干细胞的黏附，并为其增殖和分化提供非常有利的环境。干细胞微环境中的生物分子，例如TGF-β、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、Nfic（nuclear factor IC）、WNT通路信号传导分子、抗菌肽LL-37、血管紧张素Ⅱ等都可以影响干细胞的分化方向，Zarei等对犬牙进行实验，用蜂胶诱导VEGF和Ⅷ因子，新生硬组织由牙骨质样组织和其他矿化组织构成。
    有学者用外源性牙本质制备牙本质基质支架，为牙髓干细胞提供具有生物活性的细胞外基质，动物实验显示修复性牙本质再生。有学者指出，单独使用PRP支架与引血产生血凝块的患牙在根长与根管直径的变化方面无明显差异，但PRP支架与干细胞结合使用后结果令人满意。Zhu等将高生长因子支架PRP与牙髓干细胞结合，发现了软组织和硬组织的形成增加，Chai等观察到人牙髓干细胞分化为成牙本质细胞并形成修复性牙本质，但Torabinejad等的类似实验结果出现牙根内吸收、根尖周肉芽肿等病态变化。另外有学者称支架和生长因子对牙根发育和根尖周愈合方面没有明显作用，因此对干细胞结合生物支架的机制及精确调控仍需进一步研究。
    3.促进牙髓血运重建术后根管内矿化组织形成的临床决策
    AAE给出了牙髓血运重建术的三级结局指标，第一级为消除症状并有骨愈合，第二级为根部厚度和/根部长度的增加，第三级为活力测试阳性。临床操作前后的诊疗决策将影响牙髓血运重建术术后根管内矿化组织的形成。
    第一，对根管内矿化组织性质的预期。根管内矿化组织的性质与数量与预后息息相关，最理想的结果是形成修复性牙本质，最不理想的则是根尖周硬组织直接通过开放的根尖孔与根管内硬组织相通。由于牙髓组织再生的技术尚不成熟，目前根管内矿化组织为类牙骨质组织的情况能满足AAE的第一级和第二级指标，并获得较好的预后。有文献指出，根管内形成类牙骨质矿化组织的预后优于类骨矿化组织，即DAMT有序形成的预后优于BI。无法完全封闭的根尖常与BI并存，BI的存在可能是牙髓血运重建失败率较根尖诱导成形术更高的原因之一。对牙本质进行一定的脱矿处理，例如增加乙二胺四乙酸（EDTA）冲洗步骤，可使牙本质表面形成毛发状突起结构，使DAMT与牙本质间形成锁结连接形式，可促进DAMT的生成并提高新矿化组织与原根管的附着强度。
    第二，术中可采用一些措施来减少根管感染，提高矿化组织形成的量和质量。
    ①使用适宜浓度的三联抗生素溶液（环丙沙星、甲硝唑和米诺环素）。新近研究显示，除了对根管系统进行消毒外，环丙沙星和甲硝唑的组合还具有免疫调节作用，可能有助于根尖愈合。
    ②优化冲洗方案。有研究显示，浓度为6%的高浓度次氯酸钠溶液比1.5%浓度更有利于促进牙根增长。辅以17%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液或纳米气泡增强型抗菌剂等，进一步去除牙本质玷污层，提高抗菌效果。
    ③使用人工支架可减少感染。相比形成血凝块的病例，使用PRP等人造支架发生根尖周炎症比例更低，且出现根管完全钙化的可能性也明显降低。
    ④选择性能更佳的盖髓剂。盖髓剂密封灭菌效果与术后根管炎症相关，有文献指出，iRootBP比广泛使用的传统盖髓剂矿物三氧化物凝聚体（mineral trioxide aggregate，MTA）更适宜于炎症酸性环境，可提高牙本质表面牙骨质样沉积率，从而提高血运重建成功率。有文献报道，iRootBPPlus和MTA可对BMMSCs的成骨或成牙分化方向产生影响，钙离子与硅离子含量更高的iRootBPPlus将诱导更多矿化组织的形成。
    第三，术后是否干预。当牙髓血运重建实现第一级或第二级目标后，有两种方案可供选择。
    ①在不出现症状的情况下不加干预，直至根管完全钙化。根管内矿物的沉积速度难以预测，众多因素可导致根管内钙化的不均匀，甚至完全钙化。目前尚无确切证据显示牙髓血运重建术后根管钙化会影响根尖周炎愈合和根长发育，且钙化根管的疏通难度大，因此，无症状时不建议干预。
    ②随访观察，在合适的时机进行常规根管治疗，用牙胶尖充填，但充填时机尚未取得共识。这一策略有其合理性。某些维度根管看似封闭，其实根尖部分区域仍是开放的。利用部分封闭的根尖完成根管治疗，可避免未完全封闭的根尖带来根尖周感染风险。但新生矿化组织与牙本质壁的结合强度有待进一步检验，常规根管治疗可能影响这种结合，反而破坏已经封闭的根尖区域，最终造成治疗的失败。对根管充填的时机及提升牙髓血运重建术疗效的方法还需进一步研究。
    综上所述，牙髓血运重建术可提高部分牙髓或根尖感染年轻恒牙的治疗效果，术中可通过控制根管感染，人为控制支架、干细胞、局部微环境等方式促进牙髓血运重建术后根管内矿化组织的有序形成，但仍需要大量研究和临床随访观察对相关因素加以验证，提高远期疗效。