［摘 要］目的：了解P物质受体在成骨细胞、牙周膜成纤维细胞内的表达情况，探讨P物质在正畸牙周组织改建中的作用机制。方法：细胞培养和ABC免疫组织化学方法检测SP受体在成骨细胞和牙周膜成纤维细胞内的表达。结果：SP受体在成骨细胞、牙周膜成纤维细胞内均阳性表达，胞浆着色。结论：P物质可能直接作用于成骨细胞、牙周膜成纤维细胞而在正畸牙周组织改建中发挥作用。
［关键词］P物质；成骨细胞；牙周膜成纤维细胞
P物质(Subatsnce P，SP）是最早发现的神经肽。在牙周组织中已证实 有SP样神经纤维的存在，源于三叉神经节。在正畸牙齿移动过程中，牙周SP样神经纤维发生 了非常显著的反应，但SP与牙周组织改建的关系还不十分清楚。本文采用细胞培养和免疫组 织化学的方法，观察了SP受体在成骨细胞、牙周膜成纤维细胞内的表达情况，以期为SP在正 畸牙周组织改建中的作用和机理提供依据。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
兔抗SP受体多克隆抗体（Sigma，USA)，ABC免疫组化染色试剂盒（Sigma，USA），DMEM培 养液（Gibco），胎牛血清（浙江金华清湖犊牛利用研究所），胰蛋白酶（上海浦东生化试 剂厂），Ⅱ型胶原酶（Sigma，USA）。
1.2 细胞培养
1.2.1 人牙周膜成纤维细胞培养
选取青少年因正畸拔除的前磨牙，无菌条件下刮取根中 1/3的牙周膜组织。采用组织块法［1］原代培养人牙周膜成纤维细胞。将第4代细胞 用于实验。本组细胞鉴定结果为：角蛋白染色阴性（小鼠抗角蛋白单抗，ABC法免疫组 化染色）；波形丝染色阳性（小鼠抗波形丝单抗，ABC法免疫组化染色）。
1.2.2 大鼠成骨细胞培养
处死新生SD大鼠，取其头盖骨，剔除表面软组织，无菌条件下剪成1mm3大小。按酶消化法进行成骨细胞的原代培养［2］，将第4代细 胞用于实验。本组细胞鉴定结果为：BGP染色阳性（兔抗BGP多抗，ABC法免疫组化染色）；ALP染色阳性（小鼠抗ALP单抗，ABC法免疫组化染色）。
1.3 细胞免疫组化染色
分别将第4代成骨细胞、牙周膜成纤维细胞接种于培养皿中，内置盖玻 片，观察细胞爬片3d，40g/L多聚甲醛固定，供免疫组化染色。
采用ABC法，2.5ml/LTriton X-100 30min，3ml/LH2O2-甲醇消除内源性过氧化 物酶,30min；正常血清孵育30min。滴加一抗4湿盒过夜；然后37℃复温1h，湿盒中二抗37℃ 孵育1h；ABC复合物37℃1h。DAB-H2O2光镜下控制显色。上述各步骤后均用PBS振 洗3次，每次5min，空白对照用PBS代替一抗，其余步骤同上。
另设阳性对照，为大鼠脑组织冰冻切片，步骤从略。
2 结果
光镜下成骨细胞为梭形，有突起。牙周膜成纤维细胞为梭形、纺锤形或多角形。两细胞均呈 阳性染色，着色部位在胞浆，胞核为空泡状，无阳性染色（图1、2）。
图1 大鼠成骨细胞胞浆SPR染色阳性
(A：10×10 B：10 ×40）
图2 人牙周膜成纤维细胞胞浆SPR染色阳性
(A：10×10 B：10×40）
3 讨论
P物质是在初级传入无髓神经纤维（C纤维）的胞体合成，通过轴流向中枢和外周运 输。 在正常牙周组织中，SP样神经纤维分布在牙周间隙的中份和根尖区域并伴随着血管。在正畸 牙齿加力时，神经末梢受到刺激，通过轴突反射机制，P物质向外周释放，研究证实［3 ］P物质与正畸牙周组织改建的关系十分密切，并可能通过直接或间接的途径影响牙周细 胞而发挥调节作用。成骨细胞和牙周膜成纤维细胞是与正畸牙周组织改建相关的两种重要的 细胞成分，P物质如何作用于这些细胞还不十分清楚。
本实验表明，在成骨细胞内有P物质受体的阳性表达。以往的研究也证实了P物质与骨代谢 的关系非常密切。Cole［4］和Sandhu［5］等证实交感神经切断可促进外周SP 的增加和骨的吸收；Herskovits［6］进一步发现交感神经切断增加了外周SP，但 减少了股骨骨干骨膜成骨细胞对［3H］proline的摄入；Goto［7］则采用免疫组 化方 法在光镜和电镜下观察到下颌骨成骨细胞内有P物质受体的阳性表达；尽管Bjurhoim［ 8］发现SP对各种培养的成骨样细胞内的第二信号CAMP无影响，但有两种可能性：成骨细 胞内缺乏SP受体；或CAMP不作为SP作用的第二信号。本实验在成骨细胞内SP受体的发现，以 及Goto的研究结果提示第二种假设可能成立。同时本文作者已在进一步的研究中证实了SP可 明显增加成骨细胞内Ca2+水平，推测Ca2+可能为其主要的第二信号。至于SP对 成骨细胞的直接作用效果，还需深入的研究。
