【摘 要】 目的 为深入研究粘性放线菌Ⅱ型菌毛的粘附功能,对仅含Ⅱ型菌毛的T14V变异菌株5951细菌Ⅱ型菌毛的分子质量及亚单位组成进行初 步分析。方法 采用免疫印迹实验对纯化的Ⅱ型菌毛进行分子质量检测。 结果 显示分子质量为31ku一条单一的色带,表明粘放菌5951菌毛是由相同 的分子质量为31ku的亚基组成。结论 根据文献报道及本实验结果推测,粘 放菌5951菌毛分子质量为124ku,由4个相同亚基组成。
粘性放线菌(简称粘放菌)是牙菌斑的主要成分之一,早期定殖于牙面,对菌斑的形成和成长具有重要的作用。由于此菌与牙龈炎、根面龋关系密切而受到学者们的关注。典型的粘放菌具有功能和抗原性截然不同的两种菌毛,Ⅰ型及Ⅱ型菌毛。Ⅰ型菌毛主要促进粘放菌对牙面的粘附,Ⅱ型菌毛主要促进粘放菌与其它细菌(如变链菌、血链菌等)之间的凝集。因此,Ⅰ型及Ⅱ型菌毛是粘放菌致病的毒力因子,许多学者致力于其结构和功能的研究,已提取纯化了Ⅰ、Ⅱ型菌毛,制备出了Ⅰ、Ⅱ型菌毛的多抗及单抗,并已对克隆化亚单位进行了研究。然而至今仍不清楚粘放菌菌毛的分子量大小如何,有多少亚单位组成。本实验拟用Ⅱ型菌毛特异性抗血清,通过免疫印迹法,分析粘放菌5951(只含Ⅱ型菌毛的T14V变异株)菌毛的分子质量及其亚 单位组成,为深入研究粘放菌菌毛提供依据。
1 材料与方法
1.1 细菌收集
将粘放菌T14V变异株5951(只含Ⅱ型菌毛)接种于双倍浓度TSB中,在37℃,90%氮气,10% CO2条件下培养48h。离心(2000g,15min,4℃),沉淀的细菌用0.01mol/L PBS(pH7.0)洗涤三次。
1.2 Ⅱ型菌毛提取
将收集的细菌悬浮于0.01mol/L PBS(pH7.0)中,超声处理5min(CPS-2型超声粉碎机,工作频率20±1kHz,上海超声波仪器厂)离心(12000g,20min,4℃)。上清液中加入50%饱和硫酸铵,置冰箱中过夜后离心(16000g,30min,4℃)。以0.01mol/L(pH7.0)溶解沉淀,透析48h即得Ⅱ型菌毛初提物。
1.3 Ⅱ型菌毛纯化
将初提物通过葡聚糖凝胶G100柱层析纯化,洗脱液为0.01mol/L PBS(pH7.0),洗脱速度1.5ml/min,用自动收集器收集,各管在日立UV-3100紫外分光光度计上测A280值。
1.4 Ⅱ型菌毛鉴定
将菌毛初提物及过柱后所得各峰与Ⅱ型菌毛特异性抗血清(华西医科大学岳松龄教授惠赠)进行对流免疫实验。
1.5 免疫印迹实验
将初提物及纯化菌毛通过SDS-PAGE电泳∶浓缩胶3.3%,分离胶12.8%,上样量10～15μl,上槽缓冲液pH 8.64,下槽缓冲液pH 9.18(Bio-Rad配方)。采用不连续电泳,浓缩胶为15mA, 分离胶为25mA,2～3h。电泳完毕后将凝胶上电泳条带转印于硝酸纤维膜上,与特异抗血清(1 ∶2稀释)孵育1h,再加入酶标二抗(羊抗兔IgG,1∶50稀释)孵育0.5h后,加入酶底物显色。
2 结 果
在初提物与特异抗血清对流免疫实验中呈现清晰沉淀线,表明初提物中确有Ⅱ型菌毛存在(图1)
图1 对流免疫实验
Fig.1 Convectional immune test
左:特异抗血清;右:Ⅱ型菌毛粗提物
初提物经G100凝胶柱层析后,共出现4个峰,当与特异抗血清进行对流免疫实验时,只有第一峰产生明显的沉淀线,表明Ⅱ型菌毛存在于第一峰中。免疫印迹实验发现,无论初提物还是纯化的Ⅱ型菌毛都显示一条单一的分子质量为31ku的色 带(图2)。
图2 免疫印迹实验
Fig.2 Immune blot test
1.Ⅱ型菌毛粗提物;2.G100过柱后Ⅳ峰
3 讨论
从本世纪70年代末开始,人们对粘放菌进行了大量的研究。Cisar等利用粘放菌参考株ATCC T14V的耐链霉素耐药菌株筛选出了只含Ⅰ型菌毛的菌株5519和只含Ⅱ型菌毛的菌株5951以及不含任何菌毛的菌株147,从而使人们有可能对不同菌毛的功能进行研究。通过实验已经了解到粘放菌粘附到牙面主要是靠Ⅰ型菌毛,Ⅱ型菌毛则主要与链球菌属产生凝集反应,两种菌毛共同作用促进菌斑的形成和成熟［1，2］。
此后,许多学者即致力于菌毛结构和功能的研究。但到目前为止,对菌毛的结构、亚基组成及分子质量还不十分清楚。主要原因是不同菌株菌毛的化学特性有差异,多数菌株的菌毛难以 解离或只能部分解离,故很难通过SDS-PAGE电泳测定其分子质量及亚单位结构。Masuda ［3，4］等曾用加SDS和2-巯基乙醇煮沸,二硫苏糖醇(DTT)降解及碘乙酰胺烷基化等方 法解离菌毛,发现多数菌株菌毛在SDS-PAGE电泳中不进入凝胶,表明未被解离。只有WVU627、TF11、B236的菌毛能够进入凝胶。WVU627在SDS-PAGE电泳中呈现一条64ku的电泳带,TF11在煮沸60min后(1.2% SDS-1.3% 2-巯基乙醇)也呈现一条64ku的电泳带,表明菌毛已被完全离解。B236在SDS-PAGE电泳中出现两个条带,一条为45ku,另一条未很好进入凝胶,表明未被完全解离。Yeung［5］等曾报道T14V Ⅰ型菌毛煮沸5min,在SDS-PAGE电泳中呈现65ku和35ku的清晰条带,65ku以上则是堆积的模糊条带,表明T14V Ⅰ型菌毛可被部分解离为65ku及35ku的蛋白,Yeung等认为35ku的条带是65ku相对稳定的降解产物。Donkersloot［6］也报道T14V Ⅱ型菌毛煮沸10min,在SDS-PAGE电泳中呈现85ku,59ku及34ku的清晰条带,85ku以上为堆积的模糊条带。表明T14V Ⅱ型菌毛可被部分解离为85ku,59ku和34ku的蛋白,Donkersloot等也认为89ku的蛋白可进一步降解为59ku及34ku的条带。由此推测,如果T14V Ⅰ型菌毛完全解离应是35ku的单一条带,T14V Ⅱ型菌毛完全解离应是34ku的单一条带。本实验所用菌株5951为T14V只含Ⅱ型菌毛的变异株,其菌毛煮沸3min后,在SDS-PAGE电泳中呈现31ku的单一条带,表明已被完全解离,这与T14V Ⅱ型菌毛完全解离应是34ku的单一条带的推测接近,故可以认为5951菌毛是由31ku的亚基组成。但菌毛中究竟含有多少个这样的亚基呢?已知一般组成蛋白质的亚基数多为偶数,并以2～4个亚基居多［7］,又从Donkersloot的实验可推知,粘放菌T14V Ⅱ型菌毛分子质量当在85ku以上。由此可以认为,粘放菌5951的菌 毛由4个31ku的亚基组成,分子质量为124ku。
