基因重组乳链球菌防龋疫苗免疫定菌鼠的实验研究

Ⅱ：实验龋齿记分研究*

摘要　目的：了解基因重组乳链球菌防龋疫苗的抗龋效果。方法：采用携带有变形链球菌表面蛋白(PAc)结构基因pac的重组乳链球菌防龋疫苗HL107通过灌胃、皮下注射、粘膜下注射三种途径对50只定菌鼠进行免疫，统计龋齿记分进行比较。结果：经过重组乳链球菌免疫的大鼠口腔内龋齿记分明显低于未重组的乳链球菌LM0230免疫组。结论：基因重组乳链球菌能有效预防龋病的发生，可望在将来作为一种新的免疫原用于龋病的免疫学预防中。
关键词　基因重组乳链球菌　疫苗　免疫　定菌鼠

　　龋病是一种多因素感染性疾病，变形链球菌是主要致病菌。变形链球菌细胞表面具有一种分子量为190KDa的表面蛋白(PAc)［1］，PAc作为亚单位疫苗可以预防恒河猴龋齿［2］，抗PAc的单克隆抗体亦可阻止变形链球菌在牙面的聚集和附着、防止龋病的发生［3］。本研究就是利用携带有变形链球菌表面蛋白结构基因的重组乳链球菌HL107对实验动物进行免疫，旨在观察重组乳链球菌HL107免疫防龋效果。

材料和方法

　　一、菌种和培养基
　　1.基因重组乳链球菌HL107接种于含有5μg/ml红霉素的LM17培养基中，30℃培养48h。
　　2.乳链球菌LM0230接种于LM17培养基中，30℃培养48h。
　　3.变形链球菌Ingbritt接种于TYB培养基中，95%N2、5%CO2厌氧培养，37℃48h。
　　以上菌种和培养基均取自湖北医科大学口腔医学院中心实验室。
　　二、细菌悬液的制备
　　活化、培养重组链球菌HL107、乳链球菌LM 0230，8000 rpm离心10min，去除培养上清液，收集菌体沉淀。用0.5%福尔马林生理盐水灭活，离心后再将经福尔马林灭活的细菌重新悬浮于0.1%福尔马林生理盐水中，使其浓度为8×108/ml(OD600=1.0)。
　　三、动物及饲料
　　Sprague-Dawley大白鼠50只(湖北医科大学动物室)。

表1　致龋饮食2000#构成成份［4］

四、免疫方案
　　50只Sprague-Dawley大白鼠随机分成5组，每组10只(雌雄不分)。Ⅰ组：HL107灌胃组；Ⅱ组：HL107皮下免疫组；Ⅲ组：HL107粘膜下免疫组；Ⅳ组：LM0230灌胃免疫组；Ⅴ组：空白免疫组+1.25ppm氟化饮水。
　　所有50只大鼠均于出生后18d断奶，喂以致龋饲料2000#，并记录体重，于鼠龄18d至20d每天免疫一次，免疫剂量为0.5ml细菌悬液。于鼠龄20d至22d喂以含有广谱抗生素的致龋饲料2000#，其中广谱抗生素(氯霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素)用量为1g/kg饲料。抗生素应用结束后，用无菌棉签涂拭幼鼠口腔再接种于轻唾培养基(Mitis Salivarius agar， MS)上，37℃、95%N2、5%CO2厌氧培养48h，观察幼鼠口腔中抗生素灭菌情况。鼠龄23d时再行免疫一次。23d至25d连续三次给幼鼠口腔中接种变形链球菌Ingbritt。于26d鼠龄时再用无菌棉签涂拭幼鼠口腔后接种于轻唾培养基上，厌氧37℃培养48h，观察大白鼠口腔中变形链球菌定菌感染情况。一周后(30d鼠龄时)连续3d免疫，第37d时再加强免疫一次。第45d鼠龄时处死大白鼠并收集大白鼠颌骨标本用于龋齿记分分析。
　　五、龋齿记分分析［5］
　　大白鼠处死后、断颅，然后将其头颅置于高压蒸汽锅中，10磅5min，取出后用手术刀剥离附着的软组织，分离出上下颌骨，清洗干净，室温干燥。将干燥的颌骨置于0.4%紫脲酸铵染液中浸泡5～12h，取出后冲洗干净，用厚0.1mm、直径25mm的金钢砂片沿上下颌磨牙牙　合面近远中向矢状半切。将半切好的颌骨标本以组为单位，在30倍体视显微镜下观察、评估鼠磨牙患龋情况，镜下龋损部位呈粉红色，而正常部位几乎不着色或着色很浅。根据Keyes经典评估龋齿的方法，将龋损破坏深度分为四级：E 龋坏仅累及牙釉质；Ds 龋坏累及牙釉质及牙本质外层1/4以内；Dm 龋坏累及牙本质厚度的1/4-3/4之间；Dx 龋坏累及深度超过牙本质厚度的3/4。根据龋损破坏范围可把鼠磨牙颊、舌、邻面及牙　合面窝沟分成若干个牙面单位，如表2所示。