[摘要] 目的 观察体外培养的大鼠第一磨牙牙乳头细胞的生物学特征。方法 大鼠第一磨牙牙乳头细胞培养，免疫组织化学染色、钙盐染色。结果 培养的大鼠牙乳头细胞表达Ⅲ型胶原、纤维黏连蛋白、碱性磷酸酶，当细胞培养于含5mmol／LB—磷酸甘油钠和50ug／mI L—维生素C的培养液中时，细胞可形成矿化的胞外基质。结论 培养的大鼠牙乳头细胞保留体内的某些特征，并可用于研究牙髓组织的钙化调节。
[关键词] 细胞培养；乳头细胞；矿化
牙乳头细胞是牙髓成纤维细胞和成牙本质细胞的前体细胞，具有较强的生长和分化能力，与牙体组织的形成和功能密切相关。体外细胞培养是研究组织和细胞特性的良好模型，具有实验条件可控制、可比性强的优点。虽然许多研究已报道了牙乳头和牙髓细胞体外生长特性「1～4」，但本实验旨在对大鼠牙乳头细胞的分离建立一种更简便有效的方法，并观察培养细胞的某些生物学特征和钙化能力。
1 材料与方法
1．1 主要试剂和仪器
DMEM培养液(美国Gibco公司)；胎牛血清(FCS，汉中卫校)；二氧化碳孵育箱(美国Fonna公司)；L—维生素C，B—磷酸甘油钠；DAB(美国Sigma
公司)；ABC试剂盒(美国Vector公司)；Ⅲ型胶原单克隆抗体(西安第四军医大学病理教研室)；纤维黏连蛋白(FN)多克隆抗体(工作浓度1：400，华美公司)；碱性磷酸酶(ALP)单克隆抗体(工作浓度1：100，西安第四军医大学免疫学教研室)。
1．2 大鼠牙乳头细胞的分离和培养
选择出生后6～7d的SD大鼠幼鼠，断头后置75％乙醇中消毒10 s，无菌条件下用挖匙取出下颌第一磨牙，分离牙胚的外层硬组织和牙乳头软组织，将软组织剪碎，均匀铺于培养瓶底，加入DMEM培养液，含10％胎牛血清、100ug／mI青霉素、100Ug/mI链霉素。培养环境为5％饱和湿度，37℃，每3 d换液，待细胞长满瓶底时，以1：2传代继续培养。将原代细胞用0．25％胰蛋白酶消化，以3X10 3／mI浓度接种于24孔培养板中，每孔1mI，孔内预先置人1cmXl cm盖玻片，3 d换液，培养液为上述液体中加入5mmol／LB—磷酸甘油钠和50Ug／mI L—维生素C，培养至，J 28d。
1．3 传代细胞组织学和钙盐染色
将培养时间分别为3d和28d的第2代细胞用4％多聚甲醛液(pH7．31)固定，培养3d的细胞行Ⅲ型胶原、ALP和FN免疫组织化学染色，28d的细胞做Von Kossa和茜素红S钙盐染色。
1．4免疫组织化学染色
常规ABC染色，一抗分别为Ⅲ型胶原、FN和ALP的单(多)克隆抗体，设置PBS代替一抗的空白对照。
2 结果
原代培养3～5d后有细胞从组织块中游出，游出的细胞呈三角形或多边形。2周后细胞基本长满瓶底。培养3 d的第2代细胞呈Ⅲ型胶原和FN的阳性表达，ALP为弱阳性表达(图1A、B、C)。随着培养时间的延长，细胞生长逐渐密集，12d时细胞生长进人融合期，15d后细胞密集生长，培养21—28d的细胞已长满玻片，细胞培养密集中心处出现基质沉积区。细胞基质沉积区可呈Von Kossa和茜素红S钙盐阳性染色，但未见细胞明显的形态改变(图1D)。
A：培养的第2代细胞均呈PN阳性表达(ABC染色 x 33)；B：培养的第2代细胞均呈Ⅲ型胶原阳性表达(ABC染色 x 33)；C：培养的第2代细胞均呈AIP弱阳性表达(ABC染色 x 33)；D：培养28d的细胞均呈Von Kossa钙盐阳性表达(↑)(Von Kossa染色 x120)
图1 体外培养大鼠的牙乳头细胞
3 讨论
牙乳头细胞在牙齿发育期间起重要作用，在一定条件下分化为成牙本质细胞。国际上多用鼠牙做细胞培养，实验有以下的优点：①材料来源稳定，细胞生长和分化阶段明确，可标准化，相互可比性强；②牙乳头细胞属胚胎细胞，有较强的分化和增殖能力，细胞易于培养；③生长早期的细胞可能具有更强的钙化能力。Hao等「5」研究人牙乳头细胞的体外矿化能力，发现人牙乳头细胞在含B—磷酸甘油钠和L—维生素C的培养条件下可形成矿化结节。
