血管内皮细胞体外培养及生物学特性的探讨

 [摘要]  目的  分离培养脐静脉内皮细胞，鉴定其生物学特性。方法  采用o．2％胰蛋白酶行脐静脉两次酶灌注消化法获取内皮细胞。分别在倒置相差显微镜、透射电镜下观察，SP免疫组化法行Ⅷ因子抗原鉴定。观察血管内皮细胞体外培养的生长情况，并绘制细胞生长曲线。结果  (1)经改良的胰蛋白酶两次消化法获取较高的活细胞百分数，且细胞纯度较高。(2)透射电镜下发现多数细胞间存在紧密连接结构，胞膜的一侧贴有基膜样成分。(3)血管内皮细胞体外培养融合成单层后，形成类似体外血管内皮的内衬结构。结论  透射电镜下细胞特征可作为鉴定血管内皮细胞的辅助手段。
[关键词]  血管内皮细胞；细胞体外培养；生物学特性
[中图分类号]  Q 813．1+1    [文献标识码]  A    [文章编号]  1003-9872(2003)01-0004-03
    海绵状血管瘤是一种血管畸形而非真性肿瘤，其血窦内皮为成熟的静脉内皮细胞组成「1～3」，因此将人体内发育正常的静脉内皮细胞(脐静脉内皮细胞)进行体外培养并施予干预，则能在一定程度上反映海绵状血管瘤内皮细胞受药物作用后病理改变情况。本实验采用新生儿脐静脉酶灌注消化法，将脐静脉内皮细胞分离并进行体外培养，并对其细胞的生物学特性进行鉴定，以便为血管内皮细胞(EC)体外培养药物干预试验奠定基础。
1 材料和方法
1．1  材料
    新生儿脐带，199培养液(日本制药株式会社，日本)，0．2％胰蛋白酶(Sigma公司)，兔抗人Ⅷ因子血清(上海生物制品研究所)。倒置相差显微镜(01ympus，日本)，透射电镜(日立H—600，日本)。
1．2方法和步骤
1．2．1  新生儿脐静脉内皮细胞的原代培养和传代：无菌条件下，取新生儿脐带(长度不少于20cm)数根，将脐带内积血取尽，置脐带保存液(NaCl 0．14mmoI/L，KCl 0．04 mmol/L，磷酸盐缓冲液0．001mol/L，葡萄糖0．001 mmoI/L，pH 7．4，青链霉素100U／mI)，4℃储存(时间不超过8h)。剪除破损或有夹痕及血肿部分，用Hanks液冲洗直至静脉内无血迹。将脐带一端用止血钳夹紧，从另一端向脐静脉内灌注0．1％胰蛋白酶，使其充盈1 min，用Hanks液将静脉腔冲洗2次，以除去粘附于内皮细胞表面的血细胞。将脐带一端夹紧，向脐静脉中灌注0．2％胰蛋白酶，止血钳夹紧另一端，置烧杯中于37℃水浴中孵育10 min。放出细胞酶溶液，并用Hanks液冲洗脐静脉，所得物一并收入烧杯中。立即加入小牛血清终止胰蛋白酶作用，离心10 min(100r／min)，弃上清液，加入199培养液(含15％小牛血清，L—谷氨酸2 mmol/L)，充分混合，0．5％锥虫蓝染色，计算活细胞百分率，以血细胞计数仪计数细胞，调整细胞数以1X10 5／mI密度于培养瓶中培养，3d换液1次。待细胞生长融合后可先传代培养。传代时弃原培养液，加入0．125％胰蛋白酶，消化分离后，弃上清液，再加入199培养液制成细胞混悬液，以1：2将细胞传人新培养瓶中培养。
1．2．2  EC的鉴定：于6孔板中培养细胞，待细胞生长融合后，在其中2孔行甲醇—冰醋酸(3：1)固定，苏木精—伊红染色，于倒置显微镜下观察细胞形态。另2孔中分别置入盖玻璃片，于同样时间将其取出，以SP法行Ⅷ因子抗原检测。将剩余2孔细胞用细胞刮取出，透射电镜观察。
1．2．3  细胞增殖数的测定：将细胞悬液以每孔2X10 4个接种至24孔培养板中，每3孔为一组，共8组，每隔24h抽查一组，以血球计数板计数，并绘制细胞生长曲线。
2  实验结果
2．1 EC形态学特征
  倒置显微镜下观察：原代生长融合的内皮细胞呈梭形或多边形，铺路石状镶嵌排列，细胞边界清楚，胞质丰富，胞核椭圆居中，核仁明显，偶见双核(图1)。传代的内皮细胞核变圆，胞质空亮，形态多样。SP免疫组化法观察：原代培养的内皮细胞胞质内有棕黄色沉淀，以核周最为明显，胞核不着色，细胞界限清楚(图2)。透射电镜下观察：在多数细胞间出现紧密连接结构(图3)，且胞膜的一侧有基底膜样成分，但胞质中未发现W—P小体。