[摘要] 目的 通过观察氟(F—)对牙胚细胞增殖及相关调控蛋白表达的影响，探讨氟斑牙的发生机制。方法 采用人牙胚体外器官培养模型，组织学观察低浓度(10mg/L)和高浓度(25mg／L)F—对细胞增殖的影响，免疫组化及图像分析技术检测F—对细胞周期蛋白(Cyclin)D1和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。结果 F—处理组细胞增殖受抑，Cyclin Dl和PCNA的表达显著降低(p<0．01)。结论 F—可能通过抑制Cyclin Dl和PCNA的表达引起细胞增殖的抑制，导致牙胚发育异常。
[关键词] 氟；器官培养；牙胚
[中图分类号] R329．28 [文献标识码] A [文章编号] 1003—9872(2003)03—0129
牙胚发育是细胞增殖分化和器官形态形成的过程，牙胚内存在广泛的细胞增殖，受一系列细胞增殖周期调控蛋白的精确调控「1」。细胞增殖及其调控异常引起发育缺陷，本实验将处于增殖期的完整人牙胚进行体外培养，采用组织学、免疫组化和图像分析技术观察氟(F—)对人牙胚细胞增殖及相关调控蛋白细胞周期蛋白(Cyclin)D1和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响，从细胞增殖方面探讨F—在牙齿发育过程中毒性作用的可能机制，为氟斑牙的防治提供理论依据。
1材料和方法
1．1 实验材料
BGJb培养基(Gibco，USA)；L—抗坏血酸(Sigma，USA)；氟化钠(分析纯，西安化学试剂厂)；PCNA单克隆抗体(Calbiochem，USA)；Cyclin D1单克隆抗体(SantaCruz，USA)；SABC免疫组化试剂盒；DAB显色试剂盒(武汉博士德生物有限公司)。24孔培养板(Cibco，USA)；YT—875型超净工作台(苏州净化设备厂)；C02孵育箱(Forma Scientific，USA)；图像分析系统(Qwin550cw，德国LEICA公司)。
1．2 实验方法
1．2．1 实验分组：以人右侧乳牙牙胚作为实验组，左侧同名牙胚作为对照组。对照组：培养液为BCJb培养基：含200ug／ml L—谷氨酰胺、200ug／L—抗坏血酸(VitC)、100 U／ml青霉素和100ug／ml链霉素。实验组：除上述培养液外另分别加入终浓度为10mg／L和25mg／L的F—。
1．2．2 人牙胚的取材及体外培养：选择流产的胎儿6例，顶臀长100—120mm，胎龄约3．5个月。无菌条件下取出全部乳牙牙胚(20个／例)，采用Trowell型培养支架在24孔培养板中培养，即将0．45／um孔径的微孔滤膜用不锈钢支架置于气—液界面，将分离完整的乳牙牙胚置于微孔滤膜上，每孔1个牙胚，培养液约1ml，在37℃、5％C02恒温孵育箱中培养，培养时间为4、8、12d，培养液每4天更换1次。
1．2．3 标本制备和组织学观察：将分别在第4、8、12天终止培养的牙胚取出用4％多聚甲醛固定24h，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，4um厚连续切片。苏木精—伊红染色，光镜观察。
1，2．4 免疫组化染色及图像分析：SABC法常规免疫组化染色，设PBS阴性对照。图像分析系统检测免疫组化染色阳性细胞平均灰度值：蛋白表达强则灰度值低；反之则高。
1．3统计学处理
所有数据均以x±s表示，采用SPSSl0．0统计软件对两组数据进行t检验，检验水准a=0．01。
2 结果
2．1 组织学观察
体外培养期间，牙胚发育程度逐步提高，在培养12 d后，对照组牙胚成釉细胞呈高柱状，与中间层分界清楚，胞核伸长远离基膜；成牙本质细胞已分化，可见明显的成牙本质细胞突起(图1)。而实验组牙胚发育明显较对照组幼稚，大部分成牙本质细胞已分化，但核不规则，形态不一。成釉细胞开始分化，核偏极，但排列紧密与中间层分界不清(图2).
图1 对照组培养12d牙胚(苏木精—伊红染色×40）
图2 实验组(25mg／L矿)培养12d牙胚(苏木精-伊红染色 x40)
