碱性成纤维fill胞生长因子和胰岛素样生长因子对大鼠外胚间充质干细胞增殖活性的影响

[摘要]  目的  探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子—1(1GF-1)对大鼠外胚间充质干细胞增殖活性的影响，为研究颅面与牙齿的发育机制及外胚间充质干细胞的诱导分化提供理论依据。方法  采用四甲基偶氮唑盐(MTF)微量酶反应比色法检测经10 ng／ml bFGF、100 ng／ml IGF-1刺激4d后大鼠外胚间充质干细胞的吸光度值。结果  培养4 d后，bFGF处理组吸光度值高于对照组(p<0．05)，而IGF-1组及bFGF+IGF-1组与对照组差异均无显著性(p>0．05)。结论  bFGF可促进大鼠外胚间充质干细胞的增殖，bFGF和IGF-1可能协同促进其分化。
[关键词]  成纤维细胞生长因子；胰岛素样生长因子；间充质干细胞；细胞增殖活性；大鼠
  碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子—1(1GF-1)在牙齿发育中对细胞的增殖和分化起重要作用「1,2」。本研究采用四甲基偶氮唑盐,(MTT)微量酶反应比色法，探讨bFGF和ICP-1对外胚间充质干细胞增殖活性的影响，为进一步研究外胚间充质干细胞的分化机制提供参考。
1材料与方法
1．1  材料
    MTF溶液：将250 mg MTT溶于50 mL 0．1 m0l／LPBS(pH7．4)中，过滤除菌后制成(由本院口腔生物学教研室提供)；细胞培养用液：含有10％新生牛血清的DMEM／P12培养液(GIBCO公司)、0．25％胰蛋白酶(GIBCO公司)；酶联免疫检测仪(DG32022型，华东电子管厂)；二甲基亚砜疫(DMSO，西安化学试剂厂)；其他试剂及器材：常规细胞培养设备、细胞计数板、96孔板等。
1．2方法及步骤
    接种细胞：用0．25％胰蛋白酶消化生长状态良好的体外培养的第4代大鼠外胚间充质干细胞，终止消化，离心，弃上清，用含有10％新生牛血清的DMEM／F12培养液再悬细胞，并加培养液稀释，形成密度为10 4液，将其分为4组：①对照组(不加因子)；②bFGF刺激组(10 ng/ml)；③IGF-1刺激组(100ng／ml)；④bFGF和IGF-1刺激组。分别加人相应的生长因子，混匀后以每孔200 ul接种人96孔培养板中，每组4孔。
    培养细胞：将培养板移人37 ℃、5％C02的孵箱中培养4d。
    显色：培养4 d后，每孔中加MTT溶液20 ul，继续培养4 h，终止培养，轻轻吸弃孔内培养液，每孔加入150 ul DMSO，振荡10 min。
    比色：在酶联免疫检测仪上，选择波长490nm，以无细胞孔调零，测定实验组各孔吸光度值(A)，记录结果。
2  结果
    不同刺激组细胞培养4 d后，采用MTT法测得的A值：对照组为0．697 5±0．078 5，bFGF组为0．827 5±0．073 2，IGF-1组为0．687 5±0．005 0，bFGF+IGF-1组为0．612 5±0．026 3。经单因素方差分析(Sigma Stat软件)，4组间比较差异有显著性(p<0．01)。
    每两组间进行q检验，bFGF组外胚间充质干细胞的增殖活性高于对照组(p<0．01)，而IGF-1组及bFGF+IGF-1组与对照组比较差异均无显著性
(p>0．05)。
3  讨论
    在颅神经嵴发育过程中，颅神经嵴向腹外侧迁移到达面突的中胚层以后，被称为外胚间充质。外胚间充质干细胞是一种具有多分化潜能的细胞，它可以进一步分化为成骨细胞、软骨细胞、牙乳头细胞、牙囊细胞、成牙本质细胞、雪旺细胞、黑色素细胞和听神经节等，并将形成上下颌骨、颞下颌关节盘软骨、牙本质、牙髓、牙骨质、牙周韧带及听神经等组织器官，因此，外胚间充质干细胞在颅面和牙齿发育的过程中起重要的作用「3,4」，其与口腔上皮之间的相互作用调控着颅面及牙齿的发育「5,6」。
    细胞增殖活性是反映细胞生长状态和生物学特性的一个重要指标，它可为进一步研究细胞提供参考。MTr比色法是检测细胞增殖活性的方法之一。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶，后者沉积于细胞中，死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490 nm波长测定吸光度值，可间接反应活细胞的数量「7」。
    在对大鼠外胚间充质干细胞培养的过程中，发现细胞在传代后培养3 d进入对数增长期，细胞增殖活跃。因此，本研究仅对培养4 d的细胞的增殖活性进行观察和分析。
    Onishi等「3」研究发现，IGF-1可能在牙髓细胞增殖和分化过程中起重要作用。本研究结果显示IGF-1对大鼠外胚间充质干细胞的增殖无促进作用，这可能是因为IGF-1主要对其分化起促进作用。Mar-tin等「4」的研究显示，aFGF和bFGF可促进牙乳头周边细胞的极化。而本研究结果显示，bFGF可明显促进大鼠外胚间充质干细胞的增殖。Martin等「4」还发现aFGF或bFGF和IGF-1联合应用，可使牙乳头表层细胞极化，但基质分泌仅限于少数样本，他们认为aFGF和bFGF与TGF-B1和IGF-1有协同作用，可增强它们的诱导作用以及促进细胞形态和功能上的变化。本研究联合应用bFGF和IGF-1，发现两种因子联合应用对大鼠外胚间充质细胞的增殖无促进作用，反而略有下降，还发现其外胚间充质细胞向成牙本质细胞样细胞分化「8」。因此认为，这可能是两者协同促进其分化的缘故。