体外培养的神经嵴细胞的定向诱导分化

[摘要]  神经嵴细胞是发育中具有多向分化潜能的干细胞，可向神经元、神经胶质细胞、软骨细胞、平滑肌细胞和黑色素细胞等多方向分化。其分化受到多种因子和化学物质的影响，包括转录因子、生长因子、钙离子浓度和细胞外基质等。
[关键词]  神经嵴细胞；诱导；分化；细胞培养
    神经嵴细胞(neural　crest　cells，NCC)和其他细胞、细胞外基质、生长因子或激素相互作用后，可以进行分化。本文从神经元、软骨细胞、黑色素细胞和平滑肌细胞4个分化方向进行综述。
1  神经元
1．1  转录因子
    HAND和MASHl两种核转录因子参与了NCC的分化。
    dHAND和eHAND均为螺旋—折叠—螺旋结构蛋白家族成员中的DNA结合蛋白。Howard等「1」克隆了鸡的dHAND(HAND2)和eHAND(HANDl)基因，并证明用反义核酸阻断这两种HAND基因的表达后，NCC分化为神经元的数量显著减少，其中儿茶酚胺(catecholamines，CA)神经元减少了52％。
如果将HAND的基因导人NCC，则可以诱导NCC向CA神经元的分化，说明NCC向CA神经元的分化需要dHAND和eHAND表达。
    MASHl也是一种螺旋—折叠—螺旋转录因子，是自律神经元形成所必需的。现已证明BMP2和BMP4正是通过诱导MASHl的表达来促进NCC向自律神经元的分化。Lo等「2」从大鼠胚胎的肠中分离出表达MASHl的NCC，这些细胞可分化为自律神经元。随着时间的推移，MASHl的表达降低，细胞的分化能力也减弱。但如果用骨形成蛋白(bone morphogenetic　protein 2，BMP2)维持内源性MASHl的表达，则可维持细胞的分化状态。MASHl的作用机制可能类似于其果蝇同源物achate—scute。
1．2  生长因子
    BMP　s通过丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK的介导，BMP s可以促进NCC向CA神经元的分化。Wu等「3」的研究表明，MAPK抑制剂PD98059或Herbimycin A可以显著地减弱NCC向CA神经元的分化。但如果在抑制剂中加入BMP4，则NCC向CA神经元的分化有所增强，这是因为BMP4本身可以单独地诱导Smadl从胞核向胞质中的转位，促进dHAND的转录。
    BMP 2也可以促进NCC向神经元的分化。实验证明，BMP2可以促进原代的NCC向TH(tyrosien hydroxYlase，TH)和CA阳性的交感肾上腺(sympathoadrenal，SA)神经元分化，但不能诱导SA系标志物的表达。对中枢神经系统(CNS)干细胞的研究表明，氧的浓度也可以影响细胞的分化状态，降低氧的浓度可以促进CNS干细胞的存活、增生，促进CA神经元的分化「4」。Morrision等「5」检测了5％O 2的生理条件下，由坐骨神经分离培养而来的NCC的生长和分化情况。在BMP2+forskdin及低氧条件下，细胞分化并表达TH和多巴胺—B羟化酶以及SA系的标志物SA—1，分泌胆碱能神经递质多巴胺和去甲肾上腺素，表明从坐骨神经分离的NCC具有表达SA的能力。Bilodeau等「4」则认为无论有无BMP2的存在，NCC
都可以表达TH和CA以及SA系基因ASH-1、Phox2a、Phox2b、GATA-2和SCGIO。NCC可由胚胎第14．5天的坐骨神经分离，也可由胚胎第10．5天的神经管培养而来，但前者比后者产生酌神经元数目要少，另外，前者主要向胆碱类副交感神经元分化。这可能是由于：①坐骨神经来源性的NCC对神经源性信号一BMP2的敏感性较低。②胆碱能神经元分化比非肾上腺神经元所需的BMP2的浓度要低。因此，NCC是向交感还是副交感神经元分化，很可能是由局部的BMP2浓度所决定的「6」。
    细胞因子：原位杂交结果证明，成纤维细胞生长因子(FGF)mRNA表达在胚胎第10天小鼠的神经管细胞和听神经胶质细胞「7」。在早期的神经嵴培养中，外源性的FGF可完全抑制神经元的分化。为了刺激神经元的分化，可将FGF换为白血病分化抑制因子(1eukemia inhibitory factor，LIF)或其他相关因子。在这种培养条件下，50％的细胞可分化为神经元，并具有听神经元的形态，且表达其标志物一降钙素基因相关肽(calcitionin generelated pepbde，CGRP)和P物质。所以，FGF的作用是刺激多潜能的神经嵴前体细胞增殖，此过程受LIF和其他细胞因子的调节。Bfill等「8」的研究与之相反，他将含人bFGF cDNA的表达载体转入BHK-21(黄金地鼠胚胎肾细胞系)，产生不同表达水平的bFGF细胞系。虽然BHK-21本身神经诱导能力很低，但用转染bFGF后的BHK细胞作滋养层，其诱导能力提高了1．5—4倍。