【摘 要】 目的：克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白 C基因(gbpC) 编码序列的特异片段。方法：根据文 献报道的gbpC序列设计并合成一对 寡核苷酸引物，PCR扩增位于gbpC编码序列1105～1554bp间的一段特异片段，扩增产物经 回收、酶切后，定向插入克隆载体puc18中，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，挑选阳性 克隆，鉴定后进行序列测定。结果：测序结果与Sato等报道的序列 一致。结论：成功克隆了gbpC基因片段，为进一步的研究（探针标 记、杂交及表达等）奠定了基础。
【关键词】 变形链球菌； 葡聚糖结合蛋白； 聚合酶链式反应； 分子克隆； 序列测定
近年来，以免疫防龋、生态防龋为远期目标，针对变形链球菌的表面 蛋白、产物等进 行的研究方兴未艾。其最终目的，均是为上述的防龋策略寻找合适的靶物质。基于在粘附、 聚集及菌斑形成中的重要作用，一个时期以来一直被忽视的葡聚糖结合蛋白（Glucan-bindi ng proteins,Gbps）逐渐引起学者们的重视。由Sato等于1997年通过随机突变法（Random m utagenesis ）发现的gbpC，可使变形链球菌在一定浓度抗生素中仍具有粘附、聚集能力， 这是一个很有意义的现象，值得进一步探讨［1］。本研究采用PCR方法，以变形链球 菌OMZ175 （S.mutans OMZ175）的基因组DNA作为模板，PCR扩增了gbpC编码区部分特异性序列并将其 克隆至puc18中，从而为后续的研究（探针标记、杂交及表达等）打下基础。
1 材料和方法
1.1 变形链球菌的培养及基因组DNA提取［2,3］
变形链球菌国际参考株S.mutans OMZ175(serotype f)厌氧培养至饱和状态, SDS+CTAB法裂 菌，酚/氯仿法提取基因组DNA。
1.2 引物设计与合成
根据Sato等（1997）报道的变形链球菌临床分离株S.mutans 109cS的gbpC序列，设计一对引 物，扩增编码序列1105～1554p间约0.45kb的特异片段，P1：5\'GCGAATTCGTTAAAATACCGG3’ ，P2：5\'ATGAGGATCCTCTGGTGTTT3\'，经电脑软件（PC-Gene及Blast）检验，符合要求。由Ta KaRa公司大连分部合成。
1.3 PCR反应
在200μl PCR反应专用管中依次加入10×PCR 缓冲液5μl, dNTPs(每种浓度10mmol/ L)1μl, P1(100mmol/L)1μl,P2(100mmol/L)1μl, 基因组DNA 10μl,加无菌去离子水至50 μl,稍离心混匀。沸水中煮沸变性10min,取出迅速置冰水中，加入Taq DNA polymerase 0.5 μl，置Eppendorf Gradient PCR仪中，按以下程序进行扩增反应：94℃ 4min；94℃ 30s， 55℃ 30s，72℃ 1.5min，5循环；94℃ 30s，68℃ 1.5min，30循环；72℃ 10min。
1.4 PCR反应产物的回收
PCR反应产物用AdvantageTM PCR-Pure Kit(Clontech Labratories Inc.USA)回收(步 骤从略)。
1.5 载体的制备
将含puc18的DH5α 菌划线接种至LB琼脂平板上（含Amp100mg/L）, 37℃培养过夜；取单 菌落接种于5ml LB培养基中（含Amp100mg/L）, 37℃，160r/min,震荡培养过夜。 取3ml菌液离心沉淀，常规碱裂解法提取质粒［5］。
1.6 连接反应
酶切反应：①PCR反应产物16.5μl，10×3号缓冲液 2μl，EcoRI、BamHI（华美公司）各0. 75μl；稍离心混匀，37℃水浴 2h; AdvantageTM PCR-Pure Kit回收（溶于20μl pH 8.0的TE中）；②puc18 16.5μl，10×3号缓冲液2μl，EcoRI 1.5μl；稍离心混匀 ，37℃水浴 2h ;增容至100μl，等体积的酚、酚/氯仿各抽提1次；2倍体积无水乙醇沉淀，700ml/L乙醇洗 涤； 晾干后溶于8μl TE(pH8.0)中；加入10×3号缓冲液 1μl，BamHI 1μl；稍离心混 匀，37℃水浴2h; AdvantageTM PCR-Pure Kit回收（溶于20μl pH8.0的TE中）。
连接反应体系： PCR反应产物5.5μl，线性化载体1.5μl，5×T4 DNA Ligase 缓冲液2μl，T4 DNA Ligase 1μl，稍离心混匀；置16℃水浴中反应16h；70℃，5 min灭活 T4 DNA Ligase，-20℃贮存备用。
