miRNA对牙再生调控机制的研究现状

    牙齿由牙釉质、牙本质、牙骨质及牙髓组成，通过牙韧带悬吊于牙槽骨中，发挥着咀嚼、美观、发音等功能。如今，随着年龄的增长以及龋病牙周病等疾病发病率的增加，越来越多的人受到牙齿缺失的困扰。牙齿缺失不仅会影响咀嚼功能，还会对美观、发音、颞下颌关节、全身健康甚至心理健康产生不良影响。目前修复缺失牙齿的方法有活动义齿、固定义齿及种植义齿。由于材料和方法的局限性，常常会对基牙、牙周组织、口腔黏膜等造成损伤，达不到预期效果。近年来，随着牙再生概念的提出，其逐渐成为一种新兴治疗理念，为人类实现“第三副牙齿”提供可能。
    研究发现微小RNA（microRNA，miRNA）在牙齿发育过程中起着关键调控作用，调节细胞增殖与分化。这一机制为牙再生提供关键思路。本文就miRNA在牙再生领域的相关研究作一综述。
    1.牙再生的概念及研究现状
    二十世纪80年代末，Robert Langer和Joseph Vacanti提出通过将细胞接种到支架材料上可以实现组织再生，这种方法被再生医学命名为组织工程学。随着组织工程技术和干细胞技术的发展，口腔研究学者们提出牙齿再生的概念，即利用干细胞在体内或体外模拟牙齿自然发育的过程，形成与天然牙相似或相同的组织。目前的牙再生研究主要分为全牙再生和部分牙再生。牙的发育和发生是一个复杂的过程，由牙源性上皮和间充质干细胞相互作用。Young等将6月龄猪的第三磨牙蕾状期牙胚取出，制备成单细胞悬液，整合到PGA-PLLA支架上，植入裸鼠大网膜内；20～30周后取出，有牙齿样结构形成。有学者将大鼠骨髓间充质干细胞与E11.5d胎鼠口腔黏膜上皮细胞混合，植入大鼠肾网膜内，3个月后可见牙齿样结构。部分牙再生主要指牙本质再生、牙髓再生及牙周膜再生。
    裴飞将牙本质基质支架复合骨髓间充质干细胞植入裸鼠皮下，2个月后发现有新的牙本质形成。体外研究证实，用含有富血小板纤维蛋白（platelet－rich fibrin，PRF）的培养基培养牙髓干细胞，PRF释放的大量生长因子促进了牙髓干细胞的增殖，同时检测到ALP活性增强，OPG含量增高，促进牙髓干细胞分化。Zhang等建立了12月龄比格犬颊侧牙周骨缺损模型，将新型介孔生物玻璃/丝纤维蛋白支架结合骨形成蛋白7（bone morphogenetic protein 7，BMP7）/血小板生长因子B（platelet－derived growth factor-B，PDGF-B）植入牙周缺损出，结果证实BMP7与PDGF-B协同作用促进牙周组织再生，尤其对急性牙周缺损创伤的愈合效果显著。
    2.miRNA概述
    miRNA由Lee在1993年首次发现，是一种长约19～25nt的小型非编码RNA，位于真核生物中，它可以通过结合靶mRNA的3个“非编码区”来诱导mRNA裂解或抑制转录，起到调控基因的目的。根据是否编码蛋白质可以将其分为两类，非编码蛋白质miRNA和编码蛋白质miRNA，以前者居多。据统计，超过60%的蛋白质编码基因表达受到miRNA的调节。miRNA广泛分布在人体内，2007年Landgraf等在26个器官中发现了340种miRNA。
    近些年来，miRNA已经被证实是调节各种细胞功能的重要生物分子，如细胞的增殖分化、代谢、凋亡等，在机体中发挥着非常重要的作用。随着对其在干细胞增殖分化中的调控作用研究不断深入，越来越多的学者把miRNA与再生医学联系起来，通过上调或抑制miRNA的表达从而实现组织再生的目的。
    3.miRNA与牙再生
    目前牙再生主要包括全牙再生（牙胚再生）、牙髓再生、牙本质再生、牙周组织再生。近几年科学家们探索了牙再生与miRNA之间的关系，研究证实miRNA在牙体牙周组织的发育与再生中扮演非常重要的角色。
    3.1miRNA在牙齿发育中的调控作用
    牙齿发育是一个复杂的长期过程，包括细胞-细胞、上皮-间充质相互作用，导致细胞分化和形态发生。与所有发育过程一样，牙齿发育也是受一系列复杂的基因级联表达调控。Li等通过微阵列的方法，检测小型猪牙齿发育过程中miRNA的表达。研究发现有212个miRNA在牙齿发育的不同阶段均有表达，但在不同类型牙齿中其表达有差异。qRT-PCR和原位杂交结果表明，miR-103、miR-107、miR-133a、mir-133b和mir-127在不同类型牙齿的各个发育阶段均有明显表达，由此推测上述5种miRNA在牙齿发育不同阶段对于牙齿形态发生发挥调控作用。另有研究发现，miRNA与牙齿数目和牙体硬组织形成有密切关系。
    Cao等敲除小鼠牙源性上皮中Dicer1，发现小鼠门牙数目出现异常（6个下门牙，4个上门牙），同时无釉质形成。推测其原因可能是由于敲除Dicer1，上皮细胞中缺乏miRNA，无法诱导细胞分化，造成成釉细胞形成缺陷。同时由于细胞分化受阻，持续增生，在多个位点形成牙胚，导致牙齿数目异常。Cao等进一步研究证实，在牙源性上皮细胞分化过程中miR-200c/141对成釉细胞起到调节作用。因此推断，miRNA对于牙胚的发育具有关键作用，正常的miRNA表达是牙齿健康发育的保障。
    3.2miRNA与牙本质再生
    牙本质是构成牙齿硬组织的一个重要组成部分，如何促进牙髓干细胞向成牙本质细胞分化，从而实现牙本质修复和再生，近年来成为学者们的研究热点。随着对miRNA研究的不断深入，发现其对成牙本质细胞分化过程起重要调控作用，为牙本质再生提供基础。包丽荣等用骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）诱导液诱导人牙髓干细胞（human dental pulp cells，hDPCs）向成牙本质细胞分化，基因芯片结果显示有36个miRNA表达出现差异（20个上调，16个下调）。qRT-PCR检测结果显示miR-30a-5p、miR-199a-5p表达明显上调，提示与成牙本质细胞矿化有关；let-7c-5p发生下调，由于let-7c可以靶向调节DMP-1（编码产生牙本质基质蛋白），推测其在成牙本质细胞方向分化过程中发挥关键作用。
    另有研究表明，上调miR-720、下调miR-145和miR-143均促进牙髓干细胞向成牙本质细胞分化。此外，Zhan等敲低和过表达牙髓干细胞中miR-143-5p，通过qRT-PCR测定miR-143-5p、Runx2、OPG和RANKL的mRNA表达情况，结果证实下调miR-143-5p可以通过OPG/RANKL信号通路促进Runx2表达，促进DPSCs分化成牙细胞。
    3.3miRNA与牙髓再生
    牙髓是疏松的结缔组织，主要功能是形成牙本质、营养、感觉和防御。牙髓具有修复和再生的能力，但受解剖因素和增龄性改变的限制。Wang等通过微阵列方法分析确定了与人牙髓细胞衰老相关的miRNA，研究发现miR-433可以负调控GRB2蛋白和RAS-MAPK信号通路，导致牙髓细胞增殖和矿化能力下降并加速细胞凋亡，因此Wang推测可以利用miR-433的调节作用促进牙髓细胞修复和再生。
    有学者比较了正常牙髓和炎症牙髓中335个miRNA的表达情况，发现有33个miRNA在炎症牙髓中表达下调，miR-150-3P，miR-584和miR-766明显上调，表明miRNA与牙髓炎症反应有密切且复杂的联系。另有研究证实，抑制miR-424表达会促进血管内皮细胞分化，促进牙髓中血管新生。因此可见，miRNA对牙髓细胞的形成及分化起重要的调控作用，为牙髓再生提供新的思路。
    3.4miRNA与牙周组织再生
    牙周组织的主要功能是支持牙齿，因此又称为牙支持组织。实现牙周组织再生是实现牙再生的重要部分。有研究证实miRNA参与并调节牙周组织炎症反应。Ogata等观察比较了正常人和牙龈炎患者牙龈组织中miRNA的表达情况。结果发现后者的hsa-miR-150、hsa-miR-223和hsa-miR-200b表达上调，hsa-miR-379、hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-214表达下调，由此推断hsa-miR-150、hsa-miR-223和hsa-miR-200b可能对牙龈炎症反应起调节作用。
    赵家珍等研究发现，牙周炎患者龈沟液内miRNA-146a表达水平显著高于健康人，并随着牙周病变程度增加而增加；接受牙周基础治疗后miRNA-146a表达降低。牙周膜干细胞具有多向分化的潜能，可作为牙周组织修复再生的种子细胞。有国内学者将牙周膜干细胞内转染miR-26a，并进行成骨分化诱导，分别于3d和7d后进行qRT-PCR检测成骨相关分化基因（骨钙素和骨桥蛋白）表达情况，发现基因表达均明显上调。提示miR-26a可以提高牙周膜干细胞的成骨能力，实现牙周骨组织再生。
    4.展望
    本文通过总结国内外最新研究成果，阐述了miRNA在牙齿发育与再生中的调控作用，对牙源性上皮细胞、牙髓干细胞和牙周膜干细胞增殖分化的影响。但其机制尚未完全清楚，仍需要科学家不断探索。随着表观遗传学和组织工程的发展，牙齿再生的研究将不断深入，从而为其真正应用于临床提供理论基础。