富血小板纤维蛋白促进上颌窦底提升术后骨再生研究进展

    上颌后牙区具有特殊的解剖结构，牙齿缺失后，由于上颌窦气化及缺乏生理性刺激等原因，剩余牙槽骨往往吸收明显。临床上常通过上颌窦底提升术来获得足够支持种植治疗的骨量，其治疗效果稳定但需要较长的愈合周期，植骨材料的应用也增加了并发症发生的风险。如何提高术后的成骨效率，加速上颌窦底提升术后的成骨过程，缩短愈合周期并减少并发症的发生是目前面临的问题。
    富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是第二代自体血小板富集物，具有独特的纤维结构与机械强度，富含白细胞、纤维蛋白及多种生长因子，既可作为细胞支架材料又兼具缓释多种生长因子的特征，具有源于自体、成骨作用好、制备方法简单、成本低廉等优点。本课题组对PRF的前期研究结果显示其具有显著加速软硬组织愈合的作用。国际上关于将PRF应用于种植相关的软硬组织增量手术的研究也已广泛开展。
    PRF应用于上颌窦底提升术中的方式有很多种，包括以修复软组织为目的修补上颌窦穿孔以及以促进骨再生为目的与植骨材料混合使用或作为单独的植骨材料使用填充于窦腔内。本课题组率先提出将PRF作为单独的植骨材料，采用上颌窦底内提升术同期植入种植体，联合内窥镜辅助应用的微创术式“PESS术”，在骨量严重不足的病例中同样取得了较理想的治疗效果。为进一步探究PRF对上颌窦底提升术后骨再生的促进作用，本文结合国内外的相关研究，针对PRF促进上颌窦底提升术后骨再生的机制研究进展及临床应用做一综述。
    1.上颌窦底提升术
    1.1 术式选择、植骨材料应用
    上颌窦底提升术主要包括侧壁开窗技术与经牙槽嵴顶技术。侧壁开窗技术又称上颌窦外提升术，经上颌窦侧壁开窗，剥离黏骨膜，植入骨移植材料，从而获得理想的骨量；但此方法手术创伤较大，可能损伤上颌窦侧壁的血管。经牙槽嵴顶技术又称上颌窦内提升术，使用骨凿从预备后的种植窝内入路，通过敲击提升上颌窦底黏膜；此方法相对微创，但更依赖术者经验。
    当剩余牙槽骨高度大于6 mm时，多选择上颌窦内提升术同期植入种植体；剩余牙槽骨高度不足4 mm时，同期植入的风险较高，多选择外提升术延期种植的方案。虽然同种异体骨、异种骨、骨代用品等多种骨替代材料在上颌窦底提升术的应用中均取得了较理想的疗效，但自体骨移植具有其他移植材料不具备的骨诱导作用，仍是骨移植材料中的金标准。
    然而自体骨来源有限，术后易发生骨吸收，常无法满足上颌窦底提升术的需求，也增加了供区并发症的风险。骨替代材料具有较好的骨传导性，能避免额外增加的供区创伤，减少术后并发症的发生率，但其缺乏骨诱导性，同时其应用本身也伴随着传播疾病的风险。目前，骨移植材料的选择仍是植骨手术所需面对的主要问题。
    1.2 上颌窦底提升术后成骨模式
    骨再生的成功有4个主要影响因素：创口的初期愈合、血管形成、干细胞迁移以及空间维持。上颌窦底提升术后的骨再生过程也主要受上述因素影响，近年来学者发现上颌窦底黏膜具有成骨潜力，从中可分离出高表达STRO-1、CD44、CD90、CD105 和CD73 等标志物的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），体外实验证实其具有成骨能力。同时Li等的研究表明，粗糙表面钛植体的纳米拓扑结构可通过影响细胞质YAP的降解，进一步激活Wnt/β-catenin通路促进骨再生。
    上颌窦底提升术联合同期植入种植体，来自上颌窦底黏膜和骨创面的MSCs可与血液成分充分接触，黏附于支架材料或植体表面并转化为成骨细胞，新形成的血管提供了重要的营养供应，构成理想的三维成骨模式。但由于上颌窦底黏膜干细胞含量不高，上颌窦解剖结构较为复杂，上颌窦底提升术后血管形成的机制也尚未阐明，这些原因导致了术后成骨效率低，常需要较长的愈合周期。
    为此有学者推荐在上颌窦底提升术后常规应用骨形态发生蛋白- 2（bone morphogenetic protein- 2，BMP-2），但受限于BMP-2的半衰期仅为1 ~ 4 h，高效稳定的递送系统是BMP-2能否发挥作用的关键。研究发现，BMP-2可促进上颌窦底黏膜来源的干细胞成骨分化，在体外共培养7 d 后观察到PRF 组细胞的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平是对照组的24倍，但同时观察到炎性细胞因子白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6的水平也显著增高，这一结果提示BMP-2的使用可能增加炎症相关的并发症发生率。现阶段研究表明，需要开发新的材料来弥补上述不足，安全有效地促进上颌窦底提升术后骨再生。
    2. PRF促进上颌窦底提升术后成骨的研究
    2.1 PRF 的一般特征及促进组织修复的机制
    第1代血小板浓缩物，包括富血小板血浆和富生长因子血浆，最早被开发用于软组织缺损的修复，此类自体血液制剂的应用具有以下缺陷：昂贵，操作复杂，制取时间较长且技术敏感性高。以PRF为代表的第2代血小板浓缩制剂对上述缺陷进行了改善，在保留缓释生长因子特性的同时，制备更为简便，静脉采血后立即以约400 ×g的离心力离心10 min，获得独特的3层纤维蛋白支架结构：底层为红细胞碎片；顶层为贫血小板血浆；中间层为PRF凝块。
    PRF凝块可直接使用，也可转化为PRF膜使用。PRF压制成膜后纤维蛋白网络更加致密，具有一定的机械强度，其极限拉伸强度可达0.29 MPa，这使得其应用有利于骨增量术后的空间维持，促进骨形成。PRF富含白细胞和血小板，可在7 ~ 14 d不断释放多种生长因子，如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和胰岛素样生长因子（insulin- like growth factor，IGF）。
    同时，Nasirzade等在体外实验中发现，PRF具有抗炎活性，能够诱导M1型巨噬细胞向M2型转化；本课题组的一项体外研究也发现PRF可抑制牙龈卟啉单胞菌脂多糖（P.g LPS）诱导的炎症反应，这些证据表明PRF也可能通过调控局部免疫微环境，促进组织修复过程。PRF纤维结构强度与细胞因子含量主要受制备过程中的离心力的影响，为了开拓PRF的应用前景，通过改变离心力和离心时间对PRF进行改良，获得了PRF的不同变体，这些变体在促进组织再生过程中发挥作用的方式与PRF相似，但各自具有不同的特点。
    通过降低离心力、延长离心时间制得改良型PRF（advanced-PRF，A-PRF），其具有更疏松的纤维蛋白支架结构和更多的生长因子及白细胞成分。与PRF相比，A-PRF中血小板及白细胞的分布更加均匀，可能具有更强的促进组织再生潜力。通过进一步降低离心力并缩短离心时间制得可注射的PRF（injectable platelet rich fibrin，i-PRF），离心完成后可保持10 ~ 15 min的可注射特性，便于临床操作，其可注射特性也更利于与生物材料混合，进一步发挥作用。
    2.2 PRF促进上颌窦底提升术后成骨的机制研究
    近年来，临床研究表明PRF可有效促进颌骨再生，在拔牙术后创口内使用PRF可加速骨愈合，有效减少边缘骨丧失；将其应用于上颌窦底提升术后可能具有促进骨再生作用。此外，尽管目前尚未观察到PRF促进上颌窦底提升术后早期血管生成的证据，但PRF含有的VEGF与血管形成直接相关。Herrera-Vizcaíno等在体外研究中发现，PRF可促进人真皮血管内皮细胞的增殖，PRF组检测到了更多的TGF-β1 及IL-1β 释放，这与MSCs 和血管内皮细胞的迁移呈正相关。
    Miron等在一项系统评价中指出，PRF 所释放的VEGF，可调控上皮细胞的有丝分裂来促进早期血管化，从而加速组织修复。以上证据均表明PRF的应用与成骨早期的血管化直接相关，将其应用于上颌窦底提升术中可能促进早期的血管形成，为骨再生提供充足的营养，加速骨再生过程。do Lago等发现，PRF还可促进MSCs向成骨细胞转化，试验组中RUNX 2等成骨相关标志物均有明显的提升。Öncü等在动物实验中发现PRF还可以改善和加速种植体的骨整合过程。
    综上，PRF的作用机制为通过促进MSCs的成骨分化与迁移、成骨早期血管化以及术后稳定的空间维持来加速上颌窦底提升术后的骨再生，在联合种植体植入时更有利于调动积极因素，形成理想的三维成骨模式。
    2.3 PRF促进上颌窦底提升术后骨再生的循证医学研究
    2.3.1 PRF与植骨材料混合应用
    人工骨移植材料缺少生长因子和细胞成分，因此术后成骨效率低，PRF 与其混合使用利于发挥优势促进再生。而对于自体骨，由于本身具有骨诱导性，目前为止学者围绕PRF与自体骨混合使用的研究较为罕见，需要系统性的研究验证此种应用方式的效果。另外，PRF混合应用骨移植材料的优势在于避免了自体骨移植的潜在风险，同时能够添加骨诱导性，而在可获取自体骨的病例中，PRF的临床应用可能受到限制。
    目前临床上颌窦底提升术中常用的植骨材料包括脱蛋白牛骨基质（deproteinized bovine bone matrix，DBBM）以及β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP），将PRF 与其混合使用以加速术后骨再生也是目前研究的热点之一。关于这一领域目前最新的一篇关于随机对照试验的Meta分析中，作者共纳入5项研究，对其中的组织形态学统计量进行合并，分析PRF的应用对骨再生的影响，发现PRF与植骨材料混合使用后，并未提示PRF在新骨形成率、移植材料留存率和软组织面积方面有显著影响。
    然而在其后的一项随机对照试验中，Pichotano等［到了不同的结果，研究人员对比了单独使用DBBM 以及DBBM与PRF混合的成骨效果，共纳入12例患者，手术方案采用侧壁开窗技术延期植入种植体，对照组仅应用DBBM，术后8 个月植入种植体时取材；试验组将PRF混合DBBM使用，术后4个月取材；组织形态计量学分析表明，试验组新骨形成率［（44.58 ± 13.90）%］明显高于对照组［（30.02 ±8.42）%］，剩余移植材料体积占比［（3.59 ±4.22）%］明显低于对照组［（13.75 ± 9.99）%］，试验组新生骨组织量达到对照组的1.4倍以上，这与前述基础研究得出的结论相符，PRF在其中发挥的主要作用即为加速愈合。
    前述Meta分析与随机对照试验结果不相符，可能由于其本身存在一些不足，导致了其分析结果不稳定。首先，研究中纳入的Nizam等的研究存在缺陷，该研究对比了PRF混合DBBM与单独使用DBBM的疗效，术后6个月的组织形态计量学分析表明PRF对疗效没有正面影响，但其仅对取得的26份样品中的21份进行了统计学分析，文章中并未报道其余样品不适合分析的原因，这可能影响到结果数据的可信度。
    此外，Cömert等的研究中比较了β-TCP与PRF混合后的临床疗效，经过6个月的愈合期后进行组织切片观察，尽管PRF+β-TCP组观察到了更多的毛细血管形成，这有利于骨形成的营养供应；但组织形态计量学结果显示PRF组的成骨量并没有明显优势，在PRF组观察到了更少的骨祖细胞，其原因不明，分析成骨效果不佳可能与此现象有关。分析其原因，该研究报道术中上颌窦黏膜穿孔概率达19.23%，对于穿孔部位采用胶原膜覆盖的方式进行了修补；然而动物实验表明，可吸收胶原膜需要1~4周的时间才会逐渐血管化并缓慢吸收，在此期间PRF的生长因子缓释已基本完成，这使得释放的生长因子无法与来自上颌窦底黏膜的细胞成分相互作用，直接导致其结果发现PRF的应用没有显著作用。
    此外，该Meta分析纳入的研究数据较少，且没有对聚类错误进行校正，上述原因均可导致结果数据不稳定，需要更多的研究数据进行验证，系统评价的结果需要进一步更新。综上，尽管先前的研究中发现PRF混合植骨材料应用于上颌窦底提升术中，对术后骨再生并无积极影响，但结果数据并不稳定，PRF 的此种应用方式是否能够促进骨再生仍需进一步研究来证明。值得一提的是，上述研究均选择侧壁开窗技术，可能是由于不植骨的经牙槽嵴顶技术已能达到较好的临床疗效，术者更倾向于选择创伤更少、成本更低的术式。
    2.3.2 PRF单独应用
    2017年Duan等研究发现，行上颌窦底提升术同期植入种植体，仅依靠种植体起到“帐篷钉”效应撑起提升后的黏膜，不植入移植材料，术后种植体存留率与使用移植材料并无明显差异，尤其对于采用经牙槽嵴顶技术以及患者骨缺损程度较轻的病例；但可能是由于仅依靠血凝块不利于稳定的空间维持与干细胞黏附，使用移植物的患者往往可获得更多的骨量提升。与血凝块相比，PRF膜的结构与强度更有利于术后空间的维持，同时能刺激成骨细胞增殖，应用PRF完全替代植骨材料更有利于降低术后并发症的发生率，PRF单独应用于上颌窦底提升术中取得了较好的临床疗效。
    Kaarthikeyan等在一项随机对照试验中对比了单独使用PRF与窦腔内充满血凝块的术后影像学表现，试验采用了侧壁开窗技术联合同期种植体植入，以种植体为“帐篷钉”辅助支撑提升后的上颌窦底黏膜，术后1年的影像学结果显示PRF组的剩余骨高度（residual bone height，RBH）增加量略高于对照组，但差异并无统计学意义，这可能是由于在广泛抬起窦底黏膜后PRF的机械强度不足以支持上颌窦底黏膜的稳定，术后成骨的空间维持主要依赖于种植体的“帐篷钉”作用。
    Molemans等在一项队列研究中，将PRF作为惟一材料应用，共进行6例侧壁开窗技术与22例经牙槽嵴顶技术的上颌窦底提升术；通过术前与术后6个月CBCT对比观察发现，新形成的骨组织完全包裹种植体顶端，侧壁开窗组平均垂直骨增量为（5.4 ± 1.5）mm，穿牙槽嵴组垂直骨增量为（3.4 ± 1.2）mm，显示出单独应用PRF可获得良好的临床疗效。
    Diss等在一项前瞻性研究中报道了单独将PRF应用于上颌窦底提升术中种植体顶端骨水平的影像学改变，研究采用经牙槽嵴顶技术通过PRF的植入抬高窦底黏膜联合同期植入种植体，在术后的影像学检查中观察到了种植体顶端连续的骨质包绕，受试者术前平均RBH 为（6.5 ± 1.7）mm，术后RBH 增加量达（3.2 ± 1.5）mm。Cho等在一项随机对照试验中，手术方案采用经牙槽嵴顶技术联合种植体的同期植入，试验组单独应用PRF作为骨移植材料，对照组注射等量的生理盐水，在术后1年的影像学检查中PRF组RBH增加量达到对照组的1.5倍以上，组间差异具有统计学意义（P < 0.05）。上述研究均证明PRF作为单独的植骨材料联合常规术式的应用可取得稳定的治疗效果。
    本课题组在一项前瞻性队列研究中提出采用经牙槽嵴顶技术联合同期植入种植体，同时使用内窥镜辅助观察，该研究在术前RBH为4 ~ 5 mm的患者队列中展开，结果发现仅应用PRF便可获得6.72 mm的垂直骨量提升，PRF显示出了较强的促进骨再生作用。这种术式要求填入的PRF膜吸血膨胀后可充满抬起的窦膜与骨创面之间的空间，保证PRF与上颌窦底黏膜、骨创面以及种植体充分接触，以发挥加速骨再生的作用。但此术式的技术敏感性较高，比较依赖于术者的操作经验，对PRF的用量也有要求，同时其结果也需要进一步的长期研究来验证。
    总之，PRF单独应用于上颌窦内提升时，能够加速组织愈合，并可能拓宽适应证。但在上颌窦外提升术中，单独使用PRF不添加其他植骨材料的研究较少，不能确定其与常规应用植骨材料相比是否具有优势。
    3.总结与展望
    随着研究的不断深入，上颌窦底提升术后的成骨模式已逐步被揭示为三维成骨模式。目前已知PRF应用于上颌窦底提升术的作用机制可能是通过细胞因子的缓释作用及白细胞成分的炎症调控作用，进一步影响上颌窦底提升术后的干细胞迁移、血管形成并加速创伤愈合来促进骨再生。
    当单独使用PRF膜作为骨移植材料时，PRF膜的机械强度可在一定程度上维持术后空间的稳定，由此来充分调动各项术后影响成骨的因素，促进术后骨再生。然而，关于PRF促进血管生成的模式研究较少。此外，上颌窦底提升术后成骨还受到生物力学因素的调控，使用PRF是否可通过改变局部生物力学条件影响细胞的迁移与增殖尚不明确，需要进行更多与这两个方面相关的PRF应用的机制研究。循证医学研究方面，尽管PRF在上颌窦底提升术中的应用方式多种多样，包括修补上颌窦底黏膜穿孔、在外提升中替代胶原膜覆盖侧壁骨窗，本研究仅针对应用PRF促进骨再生进行分析。
    主流的PRF促进上颌窦底提升术骨再生的治疗方案可总结为以下两种：①采用侧壁开窗技术，将PRF与骨移植材料混合填充于窦腔中，同期或延期植入种植体；②采用经牙槽嵴顶技术中，将PRF作为惟一的骨移植材料，联合同期植入种植体的“帐篷钉”作用维持稳定的空间。现有的研究证据表明，PRF的应用可能拓宽上颌窦内提升术的适应证，在骨量严重不足时采用第2种方案来缩短愈合周期、减少患者负担及并发症发生率是一种理论上可行的治疗方案，在此基础上搭配内窥镜的辅助应用使得手术方案更加安全可控，但这需要更多的临床研究来验证，采用这一方案也需要依赖临床医生的经验。
    尽管上述两种方案均取得了较好的治疗效果，但目前的临床研究中，均存在着样本量小、实验设计不够严谨的缺陷。PRF在上颌窦底提升术中的用量与骨缺损大小、缺失牙数目相关性尚不明确。当前的研究中，关于PRF的用量，无论是与植骨材料混合使用还是单独使用都没有统一的标准，这使得不同研究之间的结果无法合并分析。此外，尽管动物实验中观察到将A-PRF及i-PRF应用于上颌窦底提升术中可加速骨再生并明显改善术后骨再生，有利于种植体的植入；但关于A-PRF及i-PRF在上颌窦底提升术中应用的循证医学研究较少，需要更多的研究来验证其对骨再生的影响。
    总之，目前尚无高质量的循证医学证据能证明PRF是否应在上颌窦底提升术中常规应用以增强骨再生，也不能确定PRF的用法用量与骨缺损程度的相关性，未来还需要设计良好的随机对照试验对应用结果进行验证，为临床决策提供支持。