唾液外泌体在口腔鳞状细胞癌的研究进展

    口腔癌是最常见的头颈部恶性肿瘤之一，90%以上为口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）。在临床早期（T1）被检测到，存活率可达80%，但在晚期阶段就诊（T3～T4），存活率降至20%～30%。因此，早发现、早诊断、早治疗有利于提高口腔癌的治愈率和患者生存率。
    目前，口腔癌早期诊断依然依靠病理活检，此方法虽然被誉为“金标准”，但有创过程降低了患者依从性，且伴有诊断主观性特征。为此，寻找无创、客观的早期诊断方法是口腔癌早期诊断的热点。近年来，无创检测技术发展迅速。唾液作为“人体的镜子”，可以反映人体的生理和病理状态。
    由于唾液中含有脱落的口腔黏膜细胞、DNA或RNA分子、细胞因子、细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）等，且诊断中具有非侵入性、廉价、易于操作等优点，使唾液成为筛查和诊断OSCC的理想液体。但唾液蛋白和RNA离开其最佳环境时易降解，导致敏感性和特异性不足，需用蛋白酶抑制剂和核酸酶抑制剂稳定唾液成分，保持其完整性。
    外泌体可存在于唾液中，由于其在癌症发生发展过程中的生物学作用，且唾液外泌体的脂质双层结构保护外泌体的内部物质，减少了唾液的复杂性，为疾病诊断提供了更稳定和准确的临床信息。越来越多的研究人员开始关注唾液外泌体的研究，将其定义为理想生物标志物。
    唾液外泌体的研究为口腔癌早期诊断提供了新面貌和广阔前景。唾液外泌体具有一般意义外泌体的特性，属于细胞外囊泡系统，EV根据大小和来源可分为外泌体、微泡/胞外体和凋亡小体三种。外泌体起源于多泡体（multivesicular body，MVBs），通过内溶酶体途径以内泌体膜向内出芽形成。外泌体含有蛋白、核酸和脂类等生物活性分子的纳米级囊泡，在透射电镜下呈现双凹碟形或杯状形态，直径为30～150nm，密度为1.13～1.19g/mL。
    因为唾液外泌体类似细胞膜的脂质分子层可以防止内容物降解，并且在不同体液中保持其稳定性，来自宿主细胞的外泌体所携带的核酸和蛋白质在脂质分子层保护下可有效反映受试者病理生理条件。已有研究表明外泌体通过促进细胞增殖或改变微环境来参与和促进肿瘤进展全过程，现将目前唾液外泌体中成分及对预后诊断意义进行综述。
    1.唾液外泌体中的RNA
    唾液中含有多种的细胞外RNA，包括miRNA和mRNA，还有一些不参与编码蛋白的RNA分子，如PIWI蛋白相互作用RNA（piRNA）、环状RNA（circRNA）、长链非编码RNA（LncRNA）等。高通量测序显示人类唾液中最丰富的小RNA是piRNA（7.5%）和miRNA（6.0%），而与整个唾液相比，miRNA和piRNA在外泌体中富集程度更高，这一发现表明唾液外泌体中miRNA和piRNA检测可能更具特异性与发展空间。
    1.1唾液外泌体信使RNA（mRNA）
    mRNA含有宿主及口腔微生物的基因转录信息。虽然仅占细胞总RNA的2%～5%，但种类多、代谢活跃，可反映机体生理和病理状态。多项研究证明，mRNA可作为稳定分子存在于唾液中，用超速离心法提取分离全唾液的外泌体，微阵列分析显示，509个mRNA核心转录产物相对稳定地存在于外泌体中。外泌体不仅可以保护RNA在体外不被酶降解，还能够作为载体将RNA运送到靶细胞中，发挥特定的作用。在体外，荧光标记的唾液外泌体可与口腔角质形成细胞通信，将外泌体的遗传信息转移到角质形成细胞，改变基因表达。提示唾液外泌体中的mRNA可用于疾病诊断。
    1.2唾液外泌体微小RNA（miRNA）
    miRNA是一种由内源性基因编码的无编码蛋白质功能的短链RNA，通过对各自靶基因的特异性信使mRNA进行降解或翻译抑制，从而达到对靶基因表达的转录后调控。研究表明，癌细胞可以选择性地将选定的miRNA打包进入外泌体中，发挥肿瘤抑制剂或致癌剂的功能。
    外泌体中miRNA的表达模式比循环游离miRNA更贴近肿瘤组织中miRNA的表达，因此认为将外泌体中的miRNA作为生物标志物信度更高。Gai等通过电荷沉淀技术分离唾液细胞外囊泡，通过芯片技术和qRTPCR检测miRNA的差异表达，结果显示，与对照组相比，miR-512-3p和miR-412-3p在OSCC患者唾液EV中上调，ROC曲线表明二者对OSCC诊断具有较好的鉴别能力，可能作为潜在的生物标志物。
    张学武等验证外泌体miR-512-3p通过下调Gas2促进TSCC细胞增殖。Coon等研究证实miR-365在细胞外泌体或细胞外囊泡的存在，且miR-365很可能成为口腔鳞状细胞癌外泌体中的潜在生物标志物。唾液外泌体miR-24-3p是一种潜在的新型OSCC诊断生物标志物，He等报道miR-24-3p可通过靶向PER1维持OSCC细胞增殖，ROC曲线分析AUC为0.738（95%CI:0.589～0.886，P=0.02）、敏感性和特异性分别为64.4%和80.0%，对OSCC也有较好的鉴别能力。
    1.3唾液外泌体长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）
    lncRNA是一种长度超过200个核苷酸且缺乏完整的开放阅读框的不具有蛋白质编码功能的RNA，在维持肿瘤细胞干性促进肿瘤演进中具有重要作用。有报道指出，可在唾液中分离得到的外泌体lncRNAHOTAIR和MALAT-1，Tang等认为HOTAIR可作为口腔癌转移风险的潜在生物标志物，虽然MALAT-1在以往其他癌症具有区分是否转移的潜力但在口腔癌中还需进一步的数据支持。
    尽管目前lncRNA作为肿瘤诊断或预后评估生物标志物的研究尚处于起步阶段，但外泌体中的lncRNA提取方便，在环境中能够稳定存在，为进一步深入研究提供了有利条件。
    1.4唾液外泌体环状RNA（circRNA）
    circRNA是一类长的、非编码的内源性RNA分子，形成共价连续封闭环，抵抗RNA外切核酸酶。在无细胞的外泌体中，它的出现更具稳定性。有假说认为，含有环状RNA的外泌体可能被受体细胞吸收，从而影响基因表达的转录后调控，并影响肿瘤的微环境。
    良好的稳定性与较强的参与能力有望使circRNA成为唾液诊断的新型标志物。2015年，Bahn等通过高通量RNA测序和深度生物信息学分析，首次验证circRNA的存在于唾液游离碎片中。2018年，Zhao等在一项研究中首次证实hsa_circ_0001874和hsa_circ_0001971在口腔癌患者中表达上调，具有诊断OSCC的潜力。最近Ramanathan提出circRNA可以起到类似海绵一样的作用，形成circRNA-miRNA轴，调节mRNA的表达，在OSCC中，不同的环状RNA的过表达表现出肿瘤进展和肿瘤抑制作用。除了以上类型RNA外，唾液外泌体中的其他类型RNA，例如嵌合RNA，病毒RNA、tRNA、小核RNA、piRNA在口腔癌的早期诊断中也初见端倪，都具有广阔空间。
    2.唾液外泌体中的DNA
    相较于外泌体中大量的RNA，也有一些研究指向基因组DNA和线粒体DNA（mtDNA）的研究，其优势在于外泌体中包含的DNA与其来源肿瘤细胞DNA具有高度一致性，提示外泌体DNA可作为检测致癌性突变的有效生物标志物。唾液外泌体存在的DNA是循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），ctDNA是由肿瘤细胞释放到循环系统的DNA，主要来源于凋亡的肿瘤细胞、坏死的肿瘤细胞和肿瘤细胞的外排物，是游离DNA中携带肿瘤特有突变的部分DNA。
    ctDNA不仅存在血液中，也存在于其他体液中如唾液中，唾液基因组分析，ctDNA70%来自宿主，30%来自口腔微生物群，可用于液体活检。通过唾液腺超滤、被动扩散或主动转运，ctDNA可以从局部部位和血液进入唾液，携带原发肿瘤的信息，由于稀释和污染较小，唾液ctDNA的分析比血液中结果更具敏感性。Wang等在一项研究中提出在早期口腔癌唾液中检测ctDNA敏感性为100%。
    ctDNA的关键在于其反应原发肿瘤的特异性基因组改变:包括体细胞突变、拷贝数改变、染色体易位、表观遗传改变等。多项研究表明，与健康对照组相比，口腔癌患者的唾液中ctDNA水平升高。ctDNA的存在可以通过转染健康细胞促进癌症演变发展。除此之外，研究发现异常的ctDNA甲基化与恶性肿瘤分级和淋巴节转移相关。近年来随着ctDNA研究的不断增多，提示唾液ctDNA检测可用于口腔癌的早期诊断和肿瘤复发的监测。
    3.唾液外泌体中的蛋白质标志物
    蛋白是参与口腔癌生长、凋亡和转移病理过程的重要分子，口腔癌细胞或宿主细胞分泌的激素、抗体、酶和细胞因子等蛋白不仅提供了口腔癌的全面病理信息，而且被认为是口腔癌非侵入性筛查的潜在靶点。
    随着分析高通量技术的进步，极大地提高了唾液蛋白质组学生物标志物检测的灵敏性和特异性。一些研究已经在唾液外泌体中检测到了一系列有关口腔癌的潜在标志物。Winck等用LC-MS/MS和无标签蛋白定量分析（label-free protein quantification，LFQ）了OSCC患者和健康个体的全唾液和唾液细胞外囊泡蛋白质组，细胞外囊泡的蛋白质在健康和口腔癌组之间具有显著的差异丰度，A2M、HPa、MUC5B、LGALS3BP、IGHA1、PIP、PKM1/M2、GAPDH有望成为口腔癌潜在的蛋白生物标志物。
    外泌体四跨膜蛋白如CD63、CD9和CD81在生物分子的分类、选择性募集、靶点选择、细胞特异性进入、捕获、血管生成和血管生成等方面起着至关重要的作用。Zlotogorski-Hurvitz等报道了口腔癌患者唾液内外泌体浓度和平均体积均高于健康人群，且从口腔癌患者唾液中分离的外泌体四跨膜蛋白（CD63、CD9和CD81）的表达与健康个体存在差异，即CD81和CD9水平降低，CD63水平升高。这可以作为口腔癌的诊断标志，甚至是在疾病早期阶段也能帮助检测出不易被发现的口腔癌。
    4.发展与展望
    唾液外泌体在细胞间通信、免疫调节、炎症反应、细胞分化及凋亡、肿瘤细胞生长及转移、肿瘤细胞凋亡等方面发挥重要作用。由于唾液来源的外泌体内容物反映人体病理状态，且具有稳定的特性，使得唾液外泌体能够成为一种安全、无创筛查口腔癌的理想标记物。唾液外泌体的出现无疑为实验室研究和临床应用提供了新的方向，然而唾液外泌体的检测技术和方法还需要进一步发展，在口腔癌中的生物学、作用机制有待进一步研究，应用的可靠性和有效性暂不明确，这将是未来亟待解决的问题。