牙源性干细胞在生物牙根中的应用进展

    牙齿由高度矿化的牙釉质、牙本质和牙骨质以及牙髓和牙周组织等软结缔组织构成。口腔内常见疾病如龋病、外伤和牙周病会导致牙齿缺失。牙齿缺失不仅影响发音和咀嚼，还会导致一系列的生理和心理问题。目前牙齿缺失的修复方法主要为可摘义齿、固定义齿和种植义齿。但上述方法的治疗效果是有限的，20年前出现以组织工程学原理为基础的再生医学，损伤组织修复的概念从替代向再生转化。
    随着生物医学的发展，再生医学在口腔领域取得了很大的进展。其中全牙再生方面有所探索，但由于人类牙齿生长和发育的复杂性，仍存在一些障碍，如牙齿形态失控、无法正常萌牙等。与全牙再生相比，牙根再生是一种更有前景的牙齿修复方法。2005年学者初次提出了“生物牙根”的概念，生物牙根就是利用组织工程学原理将预制根状支架与间充质干细胞结合植入牙槽骨中形成具有生理功能的牙根。影响生物牙根再生的三大主要元素包括:种子细胞、支架和诱导微环境。
    目前，应用于生物牙根再生的种子细胞主要是牙源性干细胞，包括牙囊干细胞（dental follicle stem cells，DFSCs）、牙乳头干细胞（stem cells from the apical papilla，SCAPs）、牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、脱落的乳牙干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）和牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）。本文就以上牙源性干细胞应用于生物牙根的研究进展进行阐述。
    1.牙囊干细胞（DFSCs）与生物牙根
    2005年，Morsczeck等初次从人第三磨牙牙囊中分离到DFSCs。研究表明DFSCs比DPSCs具有更高的增殖能力。为了模拟牙齿再生的微环境，Yang等将带有预处理牙本质（treated dentin matrix，TDM）支架的DFSCs植入免疫缺陷小鼠皮下。8周后，在体内形成了牙本质-牙髓样组织和牙骨质-牙周复合体。
    基于上述实验，为了更好地模拟根再生的环境，Guo等将DFSCs结合TDM植入牙槽窝。同时也将此复合体植入大网膜袋和颅窝。4周后发现只有将此复合体植入牙槽窝后才形成根，提示DFSCs具有牙槽窝内根再生的潜力。再生矿化基质的形状与原始TDM的形状高度一致，表明通过预制TDM形状可以实现模拟不同形状的根。
    Luo等将DFSCs与TDM结合，构建生物牙根复合体，同时通过计算机辅助设计，不仅成功地再生出根状结构，而且牙齿在冠修复后至少3个月内能保持稳定的咀嚼功能。这些结果表明，DFSCs可以作为一种适宜的种子细胞用于生物牙根再生。
    2.牙乳头干细胞（SCAPs）与生物牙根
    SCAPs是一种对牙髓-牙本质复合体、牙槽骨和牙根发育至关重要的牙源性干细胞，可从牙齿的根尖分离出来。SCAPs的增殖率高于DPSCs和PDLSCs，但低于DFSCs。通过划痕试验评估，与DPSCs相比，SCAPs具有更大的迁移能力。病例报告显示，在保守治疗伴有牙髓坏死和根尖周病变的未成熟恒牙后，牙根会持续发育。这种临床现象表明SCAPs可能在牙髓坏死过程中存活，并通过分化为成牙本质细胞在牙根形成中发挥重要作用。
    这提示可将SCAPs用于生物牙根再生，Sonoyama等证明通过使用SCAPs和PDLSCs可以再生具有牙周韧带组织的生物牙根。在小型猪模型中，将自体SCAPs和PDLSCs接种到羟基磷灰石/磷酸三钙（hydroxyapatite/tricalcium phosphate，HA-TCP）根形支架中，并植入牙槽骨窝中。3个月后，生物牙根形成并可支撑烤瓷冠以行使正常牙齿功能。
    3.牙髓干细胞（DPSCs）与生物牙根
    2000年，Gronthos等首次从阻生第三磨牙中分离并鉴定出具有克隆源性和牙本质样结构形成能力的DPSCs。自体SCAPs在老年患者中应用受限，而研究表明，DPSCs可以形成像SCAPs一样的牙本质样结构，它们只是相对发育年龄不同，而实际的分化能力并无差异。Wei等将含有DPSCs的根状HA-TCP支架覆盖在经过抗坏血酸诱导的牙周韧带干细胞片上，植入新生成的颌骨种植槽中，6个月后，将预制的烤瓷冠与种植义齿粘接，观察牙体功能。结果表明再生牙根在使用6个月后表现出正常牙齿的特征，包括牙本质小管状和功能性牙周韧带状结构。
    此研究认为，植入DPSCs和PDLSCs不仅通过直接参与再生过程并最终融入再生组织而影响新组织的形成，而且还通过间接机制调节宿主环境，促进了新组织的形成。这说明DPSCs也可以像SCAPs一样作为生物牙根再生的种子细胞。
    4.脱落乳牙干细胞（SHEDs）与生物牙根
    2003年，Miura等发现了一种新的间充质干细胞，这些细胞是从7～8岁儿童正常脱落的前牙中分离出来的，被称为SHEDs。与DPSCs和PDLSCs相比，SHEDs有更高的增殖率。SHEDs的独特性质源于其未成熟的干细胞特性，它能够表达胚胎干细胞标志物，具有很大的血管生成和神经向分化潜力。
    在之前的研究中，DFSCs是一种很有前景的生物牙根再生的种子细胞。然而，使用DFSCs的一个主要缺点是患者必须有未长出的第三颗磨牙或正在发育的牙根。因此，需要其他可替代DFSCs的种子细胞。与DFSCs相比，SHEDs具有更强的蛋白质合成和分泌功能，可形成有利于组织修复和再生的局部微环境。
    Yang等证实，SHEDs与DFSCs具有相似的牙源性分化能力，将SHEDs与TDM结合植入免疫缺陷小鼠的皮下可以生成牙本质和牙周组织。SHEDs可替代DFSCs成为生物牙根再生的种子细胞之一。
    5.牙周膜干细胞（PDLSCs）与生物牙根
    2004年，PDLSCs被首次从牙周韧带中分离出来，其具有增殖和在特定的分化诱导下向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的能力。此外，乳牙上残留的牙周韧带是PDLSCs的新来源，来自乳牙的PDLSCs比来自恒牙的PDLSCs具有更高的自我更新能力。PDLSCs常与其他牙源性干细胞结合用于牙根再生。在小型猪模型中，以HA/TCP的根形支架为载体，联合SCAPs和PDLSCs，产生了能够支撑预制烤瓷冠的复合体，可以获得正常的牙齿功能。
    随后的一项研究将DPSCs和PDLSCs覆盖于根状HA/TCP支架上，移植到小型猪的颌骨中，也实现了生物牙根的功能性再生。PDLSCs与其他牙源性干细胞联合应用于生物牙根再生亟待研究。目前，生物牙根的研究有限，完全形成牙根的成功率为22%，将生物牙根进行临床转化应用还需从影响生物牙根再生的三大主要因素着手继续探索。
    牙源性干细胞的主要来源是拔牙，但受牙齿本身情况及拔牙方法的复杂程度等因素影响，难以保证获得健康的牙源性干细胞，Kim等提出将有炎症的乳牙牙髓干细胞暴露于成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2，FGF-2）中，该体外实验方法可显著增强其增殖和迁移潜力，但同时降低其分化潜力。然而将暴露于FGF-2中有炎症的乳牙牙髓干细胞与HA/TCP粉末混合预培养后在体内异位移植于免疫缺陷小鼠背部皮下，8周后牙本质样结构形成增加。这一发现将丢弃的乳牙炎症牙髓组织变为一个新的有活力的细胞来源。然而，未来还需要更大样本量的研究将炎症程度与细胞增殖和分化能力联系起来。
    生物支架的植入及其降解会损害再生过程，引起免疫应答，由此提出了无支架再生的概念。而牙组织再生空间狭小，也不适合大型生物材料支架移植。因此，细胞薄片技术是一种很有前途的替代方法，它不仅提供了特定的物理形态，而且还保留了细胞间的连接和细胞外基质，也避免了胰蛋白酶消化对细胞的损伤，值得探索及应用。
    诱导微环境涉及众多元素，将干细胞支架复合体植入颌骨中，颌骨内微环境易将干细胞诱导向成骨分化，因而生物牙根再生的成功与否取决于干细胞成牙向分化。明确诱导微环境对干细胞定向分化的调控机制在生物牙根再生领域十分重要。除上述因素外，牙齿缺失后常伴有不同程度的牙槽骨和颌骨吸收，影响生物牙根预后，应用骨组织工程技术再生牙槽骨对于生物牙根的研究向临床转化也有重要意义。