口腔胶原膜生产工艺的研究进展

    早在1957 年Murray等就尝试将带有小孔的塑料网笼覆盖在狗的髂骨与股骨缺损区，通过阻挡软组织进入缺损区，成功实现骨的再生，并将其应用于脊柱融合手术中。然而直到1982 年Nyman等才正式提出引导组织再生（guided tissue regeneration, GTR）的概念，即利用屏障膜将非预期种类的组织细胞阻挡在创口外，促进预期种类的组织细胞在创口内增殖，从而实现在牙周炎患牙的牙根表面形成新的牙周附着。
    1988年Becker等将GTR概念引入骨组织的再生中，形成了引导骨再生（guided bone regeneration, GBR）的概念，即在骨缺损区，利用屏障膜维持空间并阻挡增殖较快的上皮细胞和成纤维细胞长入，保证增殖速度较慢的成骨细胞优势增长而形成骨。通常在屏障膜下方植入自体骨和/或其他骨增量材料。从此，GBR技术在口腔种植学领域得到了广泛的应用。
    据报道，约40%的患者进行种植修复时需要行GBR。应用于GBR的屏障膜可分为生物可吸收性屏障膜和不可吸收性屏障膜两大类，前者又可分为生物可吸收性胶原膜（以下将简称为胶原膜）和合成可吸收膜。其中，以Geistlich Bio-Gide为代表的胶原膜临床应用最为广泛。研究者们对理想的胶原膜特性进行了总结。
    理想的胶原膜应该同时具备安全性与有效性：（1）安全性方面：具有生物相容性，不引起免疫反应，膜的降解不能对目标组织的再生具有副作用。（2）有效性方面：①临床使用方便，抗撕裂、可缝合、质地柔韧；② 与组织能进行整合；③ 对细胞具有隔离作用；④ 具有空间维持能力；⑤ 合适的降解时间。
    目前已有的胶原膜在使用过程中仍存在以下不足：（1）难以控制和预测降解时间，可能对骨再生不利；（2）缺乏空间维持能力，需与自体骨和/或其他骨增量材料联合使用。为改进以上不足，满足胶原膜的理想性能，许多研究者致力于胶原膜的改进与创新，以期改进胶原膜在GTR、GBR及其他领域中的表现。本文将从胶原膜的分类、胶原膜的生产流程、不同胶原膜的对比、胶原膜的改良方面进行综述，希望能为胶原膜的生产工艺提供改进思路，并为临床医生选择胶原膜提供参考。
    1.胶原膜的分类
    口腔胶原膜可按照交联与否分为交联膜与非交联膜；按照来源分为同种异体、异种等；按照工艺分为脱细胞基质膜、纯化胶原膜、重组胶原膜等。本文将主要按照工艺分类进行阐述。
    1.1脱细胞基质膜：脱细胞基质膜主要是采用化学和/或物理和/或生物等方法去除组织/器官的细胞成分，同时保留其组织构架而得到的以细胞外基质（extracellular matrix, ECM）为主要成分的膜。其原材料包括：人真皮、人硬脑膜、羊膜、阔筋膜、颞筋膜、牛心包、猪心包、猪真皮、猪小肠黏膜下层（small intestinal submucosa, SIS）、猪膀胱基质（urinary bladder matrix，UBM）、猪脂肪、猪腹膜等。
    如Geistlich在其专利中提到的，年龄6~7 周龄，体重60~80 kg的猪的腹膜是制作GTR膜的最佳选择。在不同的物种中，ECM的主要成分基本相同，因此异种来源的ECM在人体内耐受良好。
    经脱细胞处理后，原材料中的结合离子、碳水化合物、球蛋白、脂质、脂肪、核酸以及内毒素等被基本去除，部分结构蛋白（包括胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白等）、糖胺聚糖（包括透明质酸、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素等）及生长因子（包括转化生长因子-β、骨形态发生蛋白-2、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子等）得以保留，同时还残留一些细胞蛋白质。原材料以及生产工艺的不同将影响最终胶原膜的成分，国家药品监督管理局对口腔胶原膜的各成分含量做了严格规定。
    1.2纯化胶原膜：纯化胶原膜是指利用动物组织提取的胶原蛋白经过物理或化学交联制备而成的膜状产品。其原材料包括：人胚骨、牛皮、牛肌腱、猪皮、猪巩膜、猪软骨、鼠尾、罗非鱼皮、鱼鳞等。根据原材料的不同，提取的胶原成分也有所不同，例如骨主要由I型胶原和III型胶原组成，软骨主要包括II型胶原以及少量的VI、IX、X、XI 和XIII型胶原，皮肤和肌腱主要包括 I 和/ 或III型胶原。
    1.3重组胶原膜：重组胶原膜是指利用基因工程技术制备的胶原蛋白经过物理或化学交联制备而成的膜状产品。重组胶原蛋白潜在的免疫原性比动物来源的胶原蛋白免疫原性更低，无病毒传染风险，纯度更高，且不同生产批次的成分几乎相同，质量稳定，生物相容性好。使用基因工程技术可以生产高纯度的各类型胶原蛋白以及胶原片段，包括I、III型胶原蛋白等。但由于重组胶原蛋白产量低，价格高等原因，由重组胶原蛋白制造的产品还未得到市场的广泛应用。
    2.胶原膜的生产流程
    2.1脱细胞基质膜的生产流程：
    （1）处理原材料：采用机械、化学等方法去除原材料中的杂质，保留目标成分。如处理猪小肠时，需使用机械方法去除浆膜层、肌层以及黏膜层。
    （2）脱细胞处理：常用的脱细胞工艺包括物理方法、化学方法和生物方法。物理方法包括冻融、高静水压、超临界二氧化碳、低剂量辐照、液氮冷冻、高渗盐水等；化学方法包括去污剂、酸、碱处理等；生物方法包括核酸酶、蛋白酶处理等，以上工艺可以组合使用。其中，物理方法的优点在于不会引入其他试剂，而使用化学方法时，由于胶原具有吸附作用，处理后需用大量的液体洗脱胶原上残留的试剂。
    Wu等对比了物理冻融以及化学洗涤剂的脱细胞效果，结果显示使用洗涤剂进行脱细胞处理更为安全和有效。化学方法中去污剂可分为：离子型去污剂（常见的是SDS）、非离子型去污剂（常见的是Triton X-100）和两性型去污剂等。其中非离子型去污剂由于其对ECM的影响更小而更受青睐。关于离子型和非离子型去污剂的选择仍有争议。
    每一种脱细胞的试剂和方法都会改变ECM的组成，并造成一定程度的超微结构破坏。脱细胞的目标是在消除原材料的免疫原性的同时，尽量减少这些不良影响。没有一种脱细胞工艺对所有的原材料都适用，例如对于皮肤、肌腱等厚组织来说，需要更长的处理时间。而对于SIS、心包等薄组织来说，需要更温和的处理方式以及更短的处理时间。
    经过适当的脱细胞处理后，组织中的细胞结构基本消失，胶原网状结构得以保留，胶原纤维排列变疏松，膜的厚度、胶原蛋白含量、各向异性、最终负荷、杨氏模量、极限拉伸强度、断裂时的最大应变无显著变化。
    （3）交联：交联为可选的流程，根据交联与否，可将胶原膜分为交联膜与非交联膜，常用的交联方法可分为化学法和物理法。常用化学交联剂有醛类（甲醛、乙二醛、戊二醛等）、异氰酸酯类（HMDI等）、碳化二亚胺类（EDC等）、双环氧类（环氧氯丙烷、 环氧乙烷等）、可水解单宁类（EGCG等）、叠氮磷酸二苯酯（DPPA）、京尼平、核糖以及转谷氨酰胺酶（TGase）等；物理交联法包括紫外线、X射线、γ射线、β射线、脱水加热等。
    使用戊二醛进行交联时，由于戊二醛在溶液中发生聚合，使得膜内部交联不均匀，同时残留的戊二醛以及交联胶原膜被酶解时释放的醛类物质可能引起细胞毒性反应，戊二醛交联还可导致组织钙化。经核糖交联的胶原膜，在动物和人体的GBR实验中，均出现了膜的骨化现象。
    尽管胶原膜的骨化在心脏瓣膜置换术中的应用是一种不利因素，然而在GBR中，膜的骨化能够实现良好的空间维持以及局部骨增量。交联后，胶原膜的变性温度（denaturation temperature,TD）升高，溶解性降低，抗胶原酶能力增强。交联程度越高，降解速率越慢。未交联胶原膜（又称天然胶原膜）的多孔结构有利于血管的长入和组织的整合，这可能会促进膜的吸收。交联程度增加，膜的血管化程度以及组织整合相应减少。
    除此之外，胶原膜具有类似半透膜的作用，交联程度的不同也会影响胶原膜的通透性。交联膜降解速率减慢的同时，在体内更易产生异物反应。交联膜与非交联膜的对照实验显示，两者在引导成骨方面无显著差别，然而交联膜有更高的术后暴露趋势。术后屏障膜暴露可对骨组织的再生产生不良影响。胶原膜的多孔表面使得其暴露后更易被细菌感染，降解速度更快，完整性被破坏，使得空间维持能力和细胞屏障能力都下降，成骨减少。然而对于GTR而言，胶原膜暴露对组织再生的影响较小。
    （4）干燥：常用的干燥方法有直接干燥、溶剂干燥（乙醇、丙酮等）、真空冻干等。其中，真空冻干技术可用于制造特定直径的微孔，较陡的冷却梯度产生小孔，较缓的冷却梯度产生大孔。关于真空冻干技术对组织机械性能的影响仍存在争议，部分研究认为真空冻干技术对细胞外基质的影响很小，部分研究认为真空冻干会造成胶原断裂，使得组织机械性能显著下降。
    （5）灭菌：常用的灭菌方法包括：环氧乙烷、γ射线、β射线、过氧乙酸（PAA）、气体等离子灭菌、超临界二氧化碳等，其中环氧乙烷与γ射线最为常用。环氧乙烷对胶原的结构或机械性能影响较小，但环氧乙烷同时具有交联功能，可改变胶原侧链上的赖氨酸与羟赖氨酸，使得其对胶原酶的敏感性降低。且环氧乙烷具有毒性、致癌性、致突变性，故灭菌后需要用干燥的热空气充分去除残留的环氧乙烷。
    γ射线同样会影响胶原结构，在较高湿度下对材料进行照射，会产生交联作用，而对干燥的胶原进行照射可破坏胶原高级结构，使其主链断裂。使用高剂量γ射线照射胶原，可使其三螺旋结构变性，释放出酰胺氮。从而导致膜的降解速度变快。
    2.2纯化胶原膜的生产流程：纯化胶原膜的生产流程包括处理原材料、提纯胶原、成型、交联、干燥和灭菌，其中处理原材料、交联、干燥、灭菌等步骤与脱细胞基质膜相似，以下仅简要介绍胶原的提纯与成型步骤。
    （1）提纯胶原：胶原蛋白的提取方法主要有碱法、盐法、酸法和酶法等。生物医用材料中胶原蛋白的提取主要采用酸法和酶法。常用的酸包括乙酸、盐酸、甲酸、乙二酸、柠檬酸等，酸法可以最大限度地保留胶原的三股螺旋结构，但与酶法相比其产率较低。常用的酶包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶等，其中胃蛋白酶最常用。
    胃蛋白酶还可催化水解胶原的端肽非螺旋区，得到去端肽胶原蛋白，使得胶原提取率增高，且进一步降低了胶原的免疫原性。胶原纤维具有四级结构：一级结构即为氨基酸序列；二级结构为肽链的局部有规律的折叠，形成左手α螺旋结构；三级结构由3 条左手螺旋多肽链相互缠绕形成一个右手三股螺旋或超螺旋，称为原胶原分子（tropocollagen），其中I型胶原为异三聚体，II、III型胶原为均三聚体；四级结构由原胶原分子首尾相接，按规则平行排列成束，通过共价键交联，形成胶原原纤维（collagen fibril），胶原原纤维进一步聚集形成胶原纤维（collagen fiber）。
    提取过程中，胶原纤维的四级结构被破坏，溶解度增强，三级结构得以保留。由于胶原蛋白在体外具有再形成性，提取的胶原可在体外进行自组装，重新形成纤维结构。但与天然完整分子相比，端肽的缺乏阻碍了原胶原分子形成原纤维的能力。由于纯化胶原的分子间化学键遭到破坏，其拉伸强度下降，降解速度变快，需要对其进行交联处理。
    （2）成型：从动物组织中提取的纯化胶原蛋白以凝胶的形式存在，还需进一步成型以形成胶原膜。常见的成型方式有灌注模具、静电纺丝、3D生物打印等。专利WO93/011723P1 中展示了用肌腱和软骨分别提取I型和II型胶原的实例，专利CA2419620C展示了利用猪软骨制作纯化II型胶原膜的实例。
    2.3重组胶原膜的生产流程：重组胶原膜的生产流程包括基因工程菌的构建与大规模培养、重组胶原蛋白的分离纯化、成型、交联、干燥和灭菌，其中成型、交联、干燥、灭菌等步骤与纯化胶原膜相似，以下仅简要介绍重组胶原蛋白技术。
    重组胶原蛋白技术：基因工程是将外源基因通过体外重组导入受体细胞内，使该基因在受体细胞内进行正常的复制和表达。用于制备胶原蛋白的表达系统包括：哺乳动物细胞、细菌、酵母（毕赤酵母，酿酒酵母，汉逊酵母等）、昆虫细胞、植物（烟草、大麦、玉米等）、转基因小鼠的乳腺、转基因鸡的鸡蛋等。
    目前商用I型胶原蛋白的大规模生产主要使用酵母和植物表达系统。除胶原蛋白编码基因外，受体细胞还需共表达一些胶原形成过程中的关键酶，如P4H、脯氨酰3-羟化酶、糖基化酶、赖氨酰羟化酶等，以模拟天然胶原蛋白的结构与功能。使用基因重组技术还可生产改良的胶原蛋白变体，即重组类人胶原蛋白（recombinant human-like collagen,rHLC）。除此之外，还可采用化学合成法合成胶原蛋白。
    重组胶原蛋白与纯化胶原蛋白同样以凝胶的形式存在，具有机械强度不足等问题，需要进行成型、交联处理。
    3.脱细胞基质膜与纯化胶原膜、重组胶原膜的对比
    ECM是组织或器官内固有细胞的分泌产物，影响细胞的迁移、增殖和分化，在生产脱细胞基质膜的过程中保存天然的超微结构和ECM的组成是非常可取的。尽管能够在纯化胶原中添加糖胺聚糖等ECM成分，但并不能完全恢复ECM的天然结构，进而可能影响纯化胶原膜的生物学性能。
    目前关于不同生产工艺的胶原膜的生物学性能的对照实验较少，Liu等对脱细胞基质膜和添加了硫酸软骨素、透明质酸等糖胺聚糖成分的纯化胶原膜进行了比较，研究结果表明脱细胞基质膜在血管生成能力方面更有优势。这提示我们，纯化胶原膜、重组胶原膜在模拟脱细胞基质膜的生物学性能方面或许还有很长的路要走。
    4.胶原膜的改良
    除以上胶原膜的基本生产工艺以外，研究者们还对胶原膜进行了各种改良，按目的可大致分为两类：①改善降解性能；②改善成骨性能。胶原膜的降解时间随材料、工艺的不同而不同。降解时间过短，胶原膜的屏障作用将减弱，而降解时间过长，则可能在伤口愈合晚期导致结缔组织延迟成熟。理想的胶原膜的降解速率应与组织重建的速率相匹配。
    根据不同的目标再生组织，需要的降解时间不同。不同组织再生所需的时间目前仍有争议，据文献报道，上皮细胞迁移的关键时间为术后前2 周，牙龈组织愈合需要2~3 周，牙周组织再生需要6~8 周，骨组织再生需要4~24 周。因此，Oh等建议GBR膜的降解时间应比GTR膜的降解时间长3~9 个月。
    为了延长胶原膜的降解时间，除了以上提及的对胶原膜进行交联处理以外，还可搭载各种抗菌药物，包括大环内酯类、硝基咪唑类、四环素类等。为改善胶原膜的成骨性能，可从骨引导、骨诱导、骨再生三方面考虑。骨引导方面，可在胶原膜中加入骨替代材料，包括羟基磷灰石、双相磷酸钙、生物活性玻璃、硅纳米粒子等。
    骨诱导方面，可在胶原膜上搭载促进成骨的药物或成骨相关细胞因子，如N-甲基吡咯烷酮（NMP）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子- β（TGF-β）、骨形态发生蛋白（BMP）等。骨再生方面，可加入骨原细胞如自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）等。此外，还可通过改良胶原膜的表面性能、颗粒大小、孔隙率和离子释放等，制造具有免疫调节作用的胶原膜，促进组织再生。
    胶原膜用于GTR、GBR技术已有30 余年的历史，目前市面上主要使用以Geistlich Bio-Gide、海奥口腔修复膜等为代表的异种脱细胞基质膜，报道的对照研究也大多局限于市售的脱细胞基质膜之间的对照，由于这些市售产品的生产专利相对保密，因此较难对研究结果进行单因素分析，不利于胶原膜生产工艺的改进。除此之外，应用纯化胶原膜、重组胶原膜的报道较少，其在GTR、GBR中的表现如何，以及与目前市场主流产品脱细胞基质膜之间有何不同还需更多的探索。