间充质干细胞来源的细胞外囊泡在牙周骨重塑中的研究进展

    细胞外囊泡（extracellularvesicles,EVs）是由细胞分泌到细胞外的囊泡结构，包裹在磷脂的双分子层中。根据颗粒的大小，它们可以分为外泌体、微囊泡和凋亡小体,可作用于靶细胞表面受体，并将内容物运送到靶细胞的细胞质中发挥作用。EVs可用于对口腔内的骨组织再生的靶向治疗，如牙周治疗中的骨再生。
    此外，EVs中的生物分子可作为骨相关疾病的生物标志物，而在口腔中，EVs存在于唾液和龈沟液中可作为评估牙周骨重塑情况的标志物。本综述就EVs在牙周骨再生中的治疗，可用于评估牙周骨重塑的相关研究，EVs在牙周骨重塑中的意义，并分析现有的EVs治疗方法和相关技术，探讨EVs促进口腔中牙周骨疾病的治疗方法。
    1.细胞外囊泡
    细胞外囊泡是包括树突状细胞、淋巴细胞、间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）在内的多种细胞均可分泌的一类囊泡结构，具有脂质双分子层膜，根据直径大小及分泌方式的不同，EVs（extracellular vesicles,EVs）分为三种亚型，包括：外泌体（exosomes）（30～150nm），来源于内体（endosome）；微囊泡（microvesicles）（100nm～1000nm），由细胞质膜向外出芽或分裂脱落产生；凋亡小体（apoptoticvesicles）（50nm～5000nm），由凋亡细胞的质膜发泡形成。
    外泌体与微囊泡是由蛋白质、核酸、脂质和其他代谢物组成的复杂脂质双层结构。凋亡小体由调亡细胞拆解而产生，在细胞清除过程中发挥关键调控作用。EVs含有膜转运和融合蛋白、四倍体和热休克蛋白以及胞质蛋白，和各种代谢酶和脂质。
    基因组分子，如信使RNA（messenger RNA,mRNA）、MicroRNA（miRNA）和长链非编码RNA（longnon-coding RNA,lncRNA），被认为是与基因表达调控相关的EVs成分，EVs中miRNA含量与亲代细胞类型和细胞状况相关。因此，不同来源的EVs可能会引起这些标记物表达的变化。此外，EVs可释放在血液、唾液和尿液等体液中，是分离EVs的重要来源。
EVs也可从细胞条件培养基中培养并分离出来，是可再生和高增益的EVs的主要生产来源。研究表明，基于EVs的治疗相对于细胞疗法更方便。然而，用于分离、存储和提纯EVs的相关技术已被证明会显著地改变EVs的生物学特性，所以EVs的运用具有一定挑战性。
    但是与现有干细胞治疗相比，EVs治疗方法具有许多优点，如高载药能力、高特异性、低免疫原性、良好的生物相容性、高稳定性、无细胞毒性和高效的细胞间作用，同时减少干细胞或生长因子治疗引起的恶性转化风险，被认为是可替代间充质干细胞MSCs的无细胞治疗方案。综上，EVs参与细胞间相互作用，如细胞间通讯、蛋白质和核酸转运和代谢等，它们可用于多种疾病的治疗和诊断方法。
    2.牙周骨重塑种子细胞的细胞外囊泡与骨重塑
    1）牙源性间充质干细胞的细胞外囊泡在骨重塑中的作用
    用于牙周再生的干细胞根据其来源可分为牙源性间充质干细胞（dental stem cells,DSCs）和非牙源性间充质干细胞，具有自我更新和多向分化潜力，分泌多种生物活性分子，在组织修复过程中起重要作用。DSC包括牙滤泡细胞（dental follicular cells,DFCs）、牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）、根尖乳头干细胞（apical papilla stem cells,SCAPs）、牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）、脱落乳牙干细胞（stem cells from exfoliated deciduous teeth,SHEDs）和牙龈间充质干细胞（gingival mesenchymal stem cells,GMSCs）。
    DPSCs来源的外泌体（DPSCs-Exos）具有强大的抗炎和免疫调节作用。例如，在体外和体内研究表明，过表达miR-140-5p的DPSCs分泌外泌体，促进软骨分化相关基因的表达，并发挥抗凋亡作用。从脱落乳牙获得的SHEDs是一种高度增殖的细胞群，在成骨方面，SHEDs来源的外泌体（SHEDs-Exos）通过上调与成骨相关的关键基因和信号通路促进PDLSCs的成骨分化，如通过Wnt3a和骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein type 2,BMP2）通路，促进成骨分化、提高碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性、上调成骨基因的表达，如runt相关转录因子（runt-related transcription factor 2，RUNX2），骨桥蛋白（osteopontin，OPN），骨钙素（osteocalcin，OCN）。
    同样，SHEDs-Exos被证明具有动员初始MSCs的能力，从而促进骨再生。PDLSCs是生长在牙周膜中的干细胞，参与牙周组织再生的调节。中牙周炎中，PDLSCs功能严重受损的P2X7受体（P2X7R）可通过基因修饰以逆转炎症介导的PDLSCs损伤，P2X7R基因修饰的干细胞条件培养基（CM-Ad-P2X7）和外泌体（EX-Ad-P2X7）用于培养PDLSCs，并改善局部炎症微环境以达到外源或内源性干细胞适应环境促进组织再生的目的，其中miR-3679-5p、miR-6515-5p、miR-6747-5p，具有促进ALP活性与矿化结节形成的能力。
    炎性微环境中，转化生长因子β（transforming growth factor β,TGF-β）/BMP信号通路通过外泌体在促进PDLSCs成骨分化中发挥重要作用。总的来说，PDLSs来源的外泌体（PDLSCs-Exos）有助于促进稳定的牙周环镜、血管生成和炎症反应下的骨形成调节。DFPCs首次从埋伏第三磨牙牙胚周围的牙滤泡中分离出来，由于成骨相关标志物如Runx2和牙本质涎磷蛋白（dentin salivary phosphoprote,DSPP）在DFPC中高表达，DFPCs较SHEDs和DPSCs具有更强的成骨特性。
    SCAPs是从未成熟恒牙的根尖乳头中分离出来，在牙根发育和牙本质再生中起着关键作用，SCAPs能够在体内形成牙周骨/牙周膜（periodontal ligament,PDL）复合物。SCAPs来源的外泌体（SCAPs-Exos）促进间充质干细胞形成牙本质，提示SCAPs-Exos可能是一种潜在的牙本质-牙髓复合体（dentin-pulp complex）再生治疗工具。
    GMSCs从健康的牙龈组织中分离，关于GMSCs来源的外泌体（GMSCs-Exos）潜在治疗应用的研究很少，但它们在组织再生方面有很大的前景。例如，从肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）预处理的GMSCs中分离出来的外泌体可诱导分化改善抗炎型M2巨噬细胞，同时GMSCs-Exos的分泌增加外泌体CD73的表达，使促炎型巨噬细胞转化为抗炎表型，减少炎性因子的分泌和表达。此外，GMSCs-Exos具有抗破骨细胞活性，并通过传递miR-1260b抑制炎症性骨丢失。
    综上，DSCs来源的EVs（DSCs-EVs）作为一种重要的旁分泌介质，可用于细胞间通讯，并且分泌和成分与微环境的变化相关，如PDLSs-Exos受炎症微环境的影响。同时细胞外囊泡与骨重塑关系的探讨仍然集中于非牙源性间充质干细胞细胞外囊泡，但是DSCs为牙周骨重塑提供了理想和标准化的EVs来源。
    2）非牙源性间充质干细胞的细胞外囊泡在骨重塑中的作用
    非牙源性间充质干细胞主要包括骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）、脂肪源性干细胞（adipose stem cells,ASCs）、胚胎间充质干细胞（embryonic mesenchymal stem cells,ESCs）、血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）、血管周围干细胞（perivascular stem cells,PSCs）、人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs）。
    其中BMSCs来源的细胞外囊泡（extracellularvesiclesderivedfromBMSCs,BMSCs-EVs）可促进邻近骨髓间充质干细胞的功能，外源性BMSCs-EVs可促进内源性BMSCs成骨分化，同时BMSCs-EVs可促进辐射照射后BMSCs的增殖并减少DNA损伤，并可通过旁分泌途径促进成骨细胞分化。miR-196a,miR-27amiR-206在BMSCs-EVs中高度富集，提高临近细胞ALP、OCN、OPN、RUNX2的表达，促进成骨功能。
    另外BMSCs-EVs中的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）通过促血管内皮细胞生成以形成血管，达到促进骨形成的作用。ASCs来源的外泌体（ASCs-Exos）也可以通过增强BMSCs的ALP活性，上调细胞外矿化结节和骨细胞生成相关基因，如Runx2，Alp和Col1a1的mRNA表达，显著地促进BMSCs的成骨分化。
    此外，过表达miR-375之后产生的ASCs-Exos可对BMSCs进行成骨诱导，促进骨形成。EPCs对BMSCs增殖与分化具有调节作用，但现有研究表示EPCs来源的EVs（EPCs-EVs）抑制了BMSCs的成骨细胞分化，促进了BMSCs的增殖，但具体作用机制不明确。
    相反，PSCs释放的EVs具有ALP活性，表达RUNX2等，促进BMSCs的增殖、迁移和成骨分化，同时诱导颅骨缺损的愈合。HUCMSCs来源的外泌体（HUCMSCs-Exos）通过表达miR-1263和Mob1信号级联反应抑制BMSCs的体外和体内凋亡，促进BMSC成骨能力。
    上述研究可见非牙源性间充质干细胞通过BMSCs间接参与骨重塑，并且研究多集中于全身性骨重塑与骨相关疾病，而对于牙周骨重塑方面研究较少，所以研究DSCs-EVs对尽快实现牙周骨重塑调控具有重要意义。
    3）其他细胞来源的细胞外囊泡调控间充质干细胞在骨重塑中的作用
    骨重塑相关细胞中，除间充质干细胞在骨重塑中发挥重要作用外，其他细胞可以通过EVs作用MSCs而参与骨重塑。骨重塑相关细胞有成骨细胞（osteoblasts，OB）、破骨细胞（osteoclasts，OC）、骨细胞（osteocytes）、内皮细胞（endothelialcells）、免疫细胞（immunecells）等。来自上述细胞的EVs，以邻近细胞为目标，并在骨重塑中的细胞通讯中发挥重要作用，其中来自矿化成骨细胞（MC3T3-E1细胞）的外泌体可被骨基质细胞（bonestromalcells,ST2）吸收，同时通过激活Wnt信号促进BMSCs的成骨分化。
    骨质疏松患者的内皮细胞来源的外泌体含有miRNA-31，可抑制BMSCs的成骨分化。树突状细胞（dendritic cells,DC）是免疫细胞的重要组成部分，参与炎症调节和促进骨缺损修复，同样作用于MSCs，引起MSCs的迁移和补充，骨形成相关蛋白的表达，促进骨修复再生。
    4）细胞外囊泡作为骨重塑标志物
    细胞外囊泡可作为骨重塑的标志物来源，其中特定成分的改变可以反映骨再生与骨吸收情况，以达到评估骨重塑状态，实现对骨相关疾病的早期诊断与早期治疗。同时，微创诊断（基于血液分析）或非侵入性诊断（使用尿液和唾液样本）是比传统穿刺或切除活检更好的选择，减少了患者的痛苦和不便，而且分析更快、成本更低。而口腔中唾液（saliva）和龈沟液（gingival sulcus fluid，GCF）是很容易通过非侵入性方法获得的液体，因其中EVs含有核酸和蛋白质，可作为疾病的生物标志物，因此，基于唾液和GCF的诊断方法可用于评估口腔健康状况。
    目前研究中已经确定了多个参与骨重塑调节的EVs标记物，其中包括核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand,RANKL），核因子κB受体活化因子（receptor activator of NF-κB,RANK）、EphrinA2、microRNA（miR-214-3p,miR-146a-5p）等。Atsawasuwan等人将miR-29作为牙齿正畸移动（orthodontic tooth movement,OTM）的第一个miRNA候选生物标志物，此外，在OTM期间，可以尝试利用GCF中RANKL和骨保护素（osteoprotegerin，OPG）表达水平的比值来研究破骨细胞的活性。
    3.骨重塑中细胞外囊泡的功能成分
    EVs可携带各种类型的细胞生物分子，包括mRNAs,miRNAs,lncRNAs和蛋白质等，其中miRNAs大约占EVs腔内RNA总数的一半，在生物分子向受体细胞转移以及细胞间通讯中发挥关键作用。研究表明，miR-21缺乏导致严重的牙周骨丢失，而miR-155的下调，部分缓解了TNF-α诱导的骨形成抑制。
    而在炎症组织中，炎症抑制PDLSCs中miR-17-5p的表达并减弱靶向能力，同时PDLSCs可能通过外泌体介导的miR-17-5p靶向（VEGFA），使牙周膜血管生成水平上调，调节人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）的血管生成。同时含有let-7i-5p、miR-22-3p、miR-17、miR-20a、miR-20b和miR106a的ASCs-Exos能够促进BMSCs向骨缺损位置的迁移，从而显著促进骨再生。
    此外，miRNAs在机械应力下的表达同样重要,压力可诱导miR-3198的表达，而拉伸降低其表达。同时，压缩和拉伸均可降低OPG表达，但诱导了（RANKL）表达，可推断miR-3198在响应机械应激时下调了OPG的表达。携带miR-196a、miR-27a和miR-206的BMSCs-Exos可以诱导MSCs的成骨分化。MSC来源的外泌体携带的miR-191、miR-222和miR-21可以促进细胞增殖，miR-10b可以促进细胞迁移，miR-1192、miR-680和miR-302a则与骨形成相关。
    OC可分泌携带miRNA-214的外泌体作用于OB，抑制其成骨和矿化活性。来自老年人或骨质疏松患者的内皮源性外泌体含有miRNA-31，可抑制BMSCs的成骨分化。
    综上，上述细胞所产生的外泌体，对受体细胞有着与细胞相同的作用而影响骨重塑，EVs来源的miRNAs是EVs发挥作用的重要中间媒介之一，可成为诊断和治疗相关疾病的重要靶点。在蛋白质成分中，EVs携带成骨相关蛋白,包括BMP1-7、ALP、真核起始因子2（eukaryotic initiation factor 2，eIF-2）和非胶原基质蛋白，如骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）、OPN、OCN和骨结合蛋白（osteointegratin,ON）等，以及成骨细胞分化相关蛋白如RANKL和RANK。
    OC与OB来源的EVs因分别具有EphrinA2和EphA2而相互作用。此外，OB外泌体的转化生长因子受体II相互作用蛋白1（transforming growth factor receptor II interacting protein 1,TRIP-1）可与I型胶原结合，促进细胞外基质矿化，这些外泌体蛋白可调节自身与相关细胞的结合，进而调节细胞功能。
    4.细胞外囊泡的应用方法
由于其在细胞间生物分子交换中的作用，EVs作为一种新型的药物传递载体具有巨大的潜力，特别是在生物治疗药物传递、跨越物理障碍的能力、固有的靶向性和生物相容性方面，有重要优势。
    虽然近年来骨再生的研究较多，但针对EVs在牙周组织再生中的具体研究较少，以下进一步讨论EVs在牙周骨再生方面潜在应用的可行依据。在免疫耐受的大鼠模型中，观察胶原海绵负载的人间充质干细胞外泌体对手术引起的牙周骨内缺损再生的治疗作用中时，可观察到牙周组织再生，包括新生骨和牙周软组织，所以PDLSCs-Exo可有效治疗牙周炎。
    而在牙周炎小鼠中，加入DPSCs-Exos的壳聚糖水凝胶（DPSCs-Exos-doped chitosan hydrogel,DPSCs-Exos/CS）可促进巨噬细胞从促炎表型向抗炎表型转化，其机制可能与DPSC-Ex中的miR-1246有关。同样已有研究报道，在动物实验中，将PDLSCs和BMSCs或其条件培养基移植到胶原海绵中可促进牙周再生。
    此外，外泌体可以通过多种方式进行修饰，例如，蛋白可以通过将编码基因与编码外泌体蛋白的基因融合而引入外泌体。其中，功能性设计的细胞外囊泡可促进骨再生，如通过慢病毒转染BMP2的表达来设计增强成骨分化的EVs，先生成转基因的人骨髓间充质干细胞（HBMSCs），进一步生成功能设计的EVs（FEEs），增强成骨诱导性能。
    结果表明，体外BMP2FEEs能够促进造血干细胞分化和BMP2信号转导，从而促进体内骨再生，同时在实验中，获得了一种转基因的稳定细胞系，即过表达BMP2的HBMSC细胞系可以持续作为成骨间充质干细胞EVs的来源，并且组成表达不会改变EVs的基本特性。综上，EVs的应用方式具有多样性，其独特的生物学特点与优势，为调控牙周骨重塑提供了方向。
    5.总结
    EVs的发现为骨重塑中的细胞间通信提供了新的见解,有利于骨合成和吸收的信号传递，参与调节骨重塑中大多数细胞的分化、增殖、迁移与活化，因此，EVs可用作潜在的治疗试剂和药物载体以实现骨再生，同时通过EVs评估骨重塑状态，可以更好地服务于骨再生，为骨重塑调控与骨相关疾病的治疗与诊断提供方向。
    DSCs-Exos作为骨重塑中重要成分，已被证明可以调节许多重要的生物学过程，尤其为口腔骨组织的再生提供了机会和方法，然而，EVs组织修复和再生的机制也尚未完全阐明。综上所述，尽管面临挑战和困难，EVs在生物医学领域仍显示出巨大的潜力，基于MSCs-EVs的治疗在牙周骨重塑中具有重要的研究意义和广阔的应用前景。