细胞膜片技术及其在种植体表面的应用进展

2018-6-13 14:06 来源:口腔医学
作者:於科 姜治伟 杨国利阅读量:611

    随着种植技术的发展,种植牙成为牙齿缺失修复的首选,然而面对一些复杂的患者,如患有骨质疏松等其他系统性疾病导致其骨密度下降,种植牙的失败率明显上升。我国正逐步进入老龄化社会,骨质疏松的患者大幅增加,全球大约有超过2亿人受此疾病的影响。因此,如何提高种植体骨结合是种植治疗的关键。在众多的种植体表面改性方法中,改变表面粗糙度和化学性质来增强种植体骨结合已经被广泛研究,如喷砂酸蚀、喷砂热化学处理、电化学沉积、激光沉积、微弧氧化等。但是对于患者本身成骨条件较差等情况时,很难利用对种植体进行物理及化学性质的简单改变而得到良好的骨结合,从而导致种植易出现失败。

    近些年来,不少学者将组织工程中的细胞膜片技术用于种植体表面改性。细胞膜片技术是一种保留细胞外基质、无需支架的细胞处理方法。确切地说,高密度接种细胞后,在无支架材料和酶消化的情况下,通过刺激细胞外基质分泌形成致密细胞片层,一般为5~8层,而完整的细胞外基质则有利于周围细胞生长。细胞膜片组织工程技术与常规植入材料相结合形成的膜片种植体,为种植体表面改性提供了新的思路,该技术明显增强了种植体的骨结合,然而,此项技术刚刚起步,面临着膜片种植体制备方法单一、体内膜片种植体存活状况未知等问题。因此,本综述将从细胞膜片及膜片种植体的制备方法、体内细胞膜片的追踪方法等方面对其进行总结,分析各类方法的优缺点,明确未来的发展方向。

    1.细胞膜片技术

    1.1细胞来源———骨髓间充质干细胞

    细胞膜片技术是组织再生领域近几年发展起来的一个研究热点,不同于散在的细胞植入,它可以完整地保留细胞之间的连接和大量的细胞外基质,具有移植细胞数量多、存活率高等优点。细胞膜片技术的细胞来源广泛,例如脂肪来源的再生细胞、成肌细胞等均可培养成膜片。相对于其他终末分化细胞,骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)具有较强的自我增殖,具有向成骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌腱细胞、神经细胞等潜在分化的能力。

    BMSCs来源丰富,且取材方便,培养的成功率高。除此之外,BMSCs植入到体内,产生的免疫反应较少,能逃避体内的免疫机制。它是一种较为理想的膜片细胞来源。因此,常采用BMSCs进行膜片种植体的制备。有研究显示BMSC膜片可以在不连续的骨折中促进骨形成,而且被证明能作为成骨植入物用于硬组织重建。进一步的研究发现,间充质干细胞分泌的生物活性分子能创造一个利于再生的微环境,限制损伤面积并帮助组织进行自我调节,从而促进组织再生。鉴于BMSC膜片在组织工程领域展现出的巨大潜力,因此,有必要总结并分析该种膜片的制备方法。

    1.2细胞膜片制备方法

    目前,BMSC膜片的培养方法仅有机械搔刮法、温度控制法和光控细胞薄层法,制备方法较单一。然而,细胞膜片技术常规有多种,如机械搔刮法、温度控制法、电化学控制法、pH控制法、离子控制法、磁性控制法等,它们各自存在优缺点。

    1.2.1机械搔刮法

    机械搔刮法操作简单,细胞在培养基中常规培养,直到形成细胞膜片,然后用细胞刮刀将细胞膜片从底层完全分离。有研究利用维生素C来制备细胞膜片,发现维生素C能够诱导牙周韧带干细胞端粒酶活性。在维生素C的处理下,细胞基质表达增加,从而更容易形成细胞膜片,并且相较于未处理过的膜片,显示出更佳的组织再生能力。在BMSCs中加入维生素C也有类似的结果,使用适当浓度的维生素C可以促进胶原增加,能够稳定和快速地构建BMSC膜片,成骨等分化能力未受影响。但是,细胞膜片在搔刮脱附的过程中可能会造成细胞结构的破坏,影响膜片的生物学活性。

    1.2.2温度控制法

    温度控制法主要是将聚N-异丙基丙烯酰胺(poly(N-isopropylacrylamide),PIPAAm)材料共价结合于培养皿基底部,形成温度培养皿。将孵育温度降低至20℃,PIPAAm会从疏水性转化为亲水性,从而能收获包含完整细胞外基质的细胞膜片。但是20℃的低温条件需要持续30min,这可能会影响细胞功能,所以有学者对相应材料进行修饰以缩短膜片分离时间。Madathil等利用自由基聚合PIPAAm和甲基丙烯酸组成新型温敏材料,依次在10℃下保存1min,20~23℃保存5min即可分离细胞膜片。相较与传统材料,它需要的时间明显变短。

    1.2.3电化学控制法

    有研究发现可以通过控制聚电解质涂层的溶解和吸附,来转换微图案化区域的生物界面性质。通过光刻在透明铟锡氧化物(indiumtinoxide,ITO)的电极上形成的绝缘微图案可局部控制聚电解质单层和多层的电化学溶解。当聚电解质底物的电化学溶解时,在ITO上生长的细胞便会分离,脱落形成细胞膜片。但是,电化学溶解聚电解质涂层时,局部pH会发生变化,不利于细胞的生长。

    1.2.4pH控制法

    有研究显示,通过局部或整体的pH降低来控制细胞膜片分离的技术是可行的。该项研究通过在导电ITO表面上交替层层沉积阳离子聚层和阴离子聚层来制备基板,研究结果显示胎盘来源的间充质干细胞易于粘附在基板表面。当pH下降至4.0时,细胞膜片可以在2~3min内完全分离。但是对于pH敏感的细胞必须谨慎使用该技术,而且局部或者整体的pH很难精准地控制。

    1.2.5离子控制法

    Zahn等研究发现,利用多价离子降解多层聚电解质(Poly electrolyte multilayers,PEM)可以制备细胞膜片。在培养成肌细胞膜片时,用聚L-赖氨酸和透明质酸与纤维连接蛋白的最顶层形成PEM,并将它们沉积在培养皿底,待细胞片层形成后加入低浓度的无毒亚铁氰化物引起聚电解质的腐蚀,从而使细胞膜片快速分离。此种方法耗时较长,工序复杂。

    1.2.6磁化控制法

    磁化控制法是指通过磁铁矿的纳米颗粒标记细胞,利用磁力帮助细胞粘附和脱附。将磁铁矿纳米颗粒与N-(α-三甲基氨基乙酰基)-二-十二烷基-D-谷氨酸氯化物混合以产生磁铁矿阳离子脂质体(magnetite cationic liposome,MCL)。Kito等研究发现,将来自小鼠成纤维细胞诱导生成的多能干细胞衍生的Flk-1(+)细胞与含磁性纳米粒子的MCL一起孵育,磁化的Flk-1(+)细胞形成了多层细胞膜片。该种方法在细胞培养时,需要加入磁场,而这种磁场是否会影响细胞的生物学活性还有待于进一步的研究。

    1.2.7光控制法

    最近还有一种光控细胞膜片技术引起了学者们的广泛关注。有学者研究并使用了TiO2纳米点介导的光控细胞薄层技术,在365nm的紫外线照射20min后,TiO2纳米点的亲疏水性发生变化,超过90%的细胞可以从基板表面脱附,研究者已经利用此方法构建了前成骨细胞膜片和小鼠胚胎成纤维细胞膜片。此外,有研究发现在具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列(Arg-Gly-Asp,RGD)吸附的TiO2纳米点上培养来源于小鼠颅盖的前成骨细胞,膜片在紫外线照射下能完整脱附,并且收获的膜片显示出比对照组更佳的细胞活力以及更强的成骨性能。

    光控制法较机械搔刮法具有对细胞损伤小、保留有完整的细胞外基质的优点,较其他方法而言,制备程序相对简单,可操作性强。尽管,细胞膜片技术发展地相对成熟,已经广泛应用于组织再生工程,其中BMSC膜片种植体已经作为促进种植体骨结合的一种重要手段之一。但是膜片种植体的细胞膜片培养还是以机械搔刮法为主,尚未见到其他方法的研究报道。因此,在今后的膜片-种植体制备中有必要尝试其他技术来获得膜片,以得到更佳的膜片种植体。

    2.BMSC膜片种植体

    2.1BMSC膜片种植体的构建

    目前,有研究报道了利用机械搔刮法来获得BMSC膜片,研究者使用细胞刮刀将膜片刮离培养皿,然后采用无菌镊子将获得的膜片手动包裹于种植体表面,置于培养基中培养保存。此种方法对膜片内的细胞和细胞外基质均有一定的损伤,开发创伤性小、简便的膜片种植体制备方法,有其必要性。本课题组利用TiO2纳米点介导的光控细胞薄层技术使细胞膜片可以完整脱附,待细胞膜片完全悬浮于磷酸盐缓冲液中,将尺寸相匹配的种植体置于膜片下方,采用无菌镊子向上提拉种植体两端,膜片便自然地包裹于种植体周围,置于50μL培养基中30min确保膜片完全贴附于种植体表面,继续在培养基内至少培养48h,可在镜下观察到复合体周围出现BMSCs生长迁移。

    2.2BMSC膜片种植体的成骨能力研究

    研究发现BMSC膜片可与两种植入物(表面改性的钛和氧化锆)组装用于构建BMSC膜片种植体,其在体内和体外具有成骨和血管化潜能。也有学者发现间充质干细胞能很好地聚集到种植体表面并保持着活力,而且仍然具有成骨能力。膜片种植体即使植入到糖尿病大鼠体内,依旧可形成大量的新骨组织。Yan等以Lipofectamine2000为载体,以非病毒的方式将anrimiR-138转染进入大鼠BMSC膜片中,从而构建了antimiR-138/BMSC膜片种植体复合物,体内外实验证明该复合物具有良好的成骨活性和骨诱导能力。此研究提示,BMSC膜片种植体具有搭载目的基因的潜能。

    3.细胞膜片的体内追踪

    众所周知,对于再生医学来说,移植后细胞的存活状况一直是该研究的关键所在。然而,到目前为止,国内外尚未建立有效的方法来追踪BMSC膜片种植体的活性。植入种植窝的BMSC膜片种植体是否仍具有生物学功能,在体内的存活时间长短直接会影响细胞膜片-种植体复合体促骨结合的效果,更是对该复合体能否成功地应用于临床至关重要。组织工程中常规的细胞示踪技术为追踪BMSC膜片种植体提供了可能,指明了研究方向,它也一直以来都是该领域的研究热点之一。目前主要的细胞示踪方法包括绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)报告基因标记、荧光素酶报告基因标记、5-溴脱氧核苷酸标记等。

    3.1GFP报告基因追踪技术

    GFP报告基因追踪技术是利用GFP独特的发光机制,将目的基因与GFP基因融合,转染进入细胞,可用于细胞的追踪定位。但与肿瘤的追踪相比,BMSC膜片种植体的植入深度要大于前者。而且,植入的膜片面临出血、炎症等环境,被骨组织、肌肉、皮肤、毛发等层层覆盖,加大了追踪的难度,这些因素造成在体内无法追踪到GFP信号。

    3.2荧光素酶报告基因追踪技术

    荧光素酶报告基因追踪技术的原理是荧光素酶与底物荧光素作用产生激发荧光,可以被小动物活体成像系统检测到,具有信号稳定,不受自发荧光干扰等优点。该技术已经广泛应用于追踪间充质干细胞的成骨分化、骨形成、肿瘤生长、治疗效率、肿瘤与宿主的免疫关系等方面。在其他领域内对细胞膜片的存活有一定时间的追踪。有研究者发现,将携带有荧光素酶报告基因的膜片植入膝关节中,利用小动物活体成像最长可以追踪到21个月以上。也有学者做过类似实验,用荧光素酶报告基因转染,CyI染料和超小超顺磁性氧化铁颗粒标记BMSCs,然后利用小动物活体成像成功追踪到BMSCs。这些研究均提示,荧光素酶报告基因可能较适合膜片种植体的体内追踪,具体还有待于进一步的研究。

    4.总结

    综上所述,细胞膜片可通过组织工程方法用于种植体表面改性,促进种植体骨结合,是一项具有前景的技术,但目前尚处于发展初期,缺乏更多的实验观察,仍有大量问题需要解决,如制备方法单一、体内存活时间未知等,离成功应用于临床还有较大的距离。细胞膜片的培养及分离技术存在各自的优缺点;在植入生物体时,种植体表面的膜片的损耗量也值得研究;对于膜片种植体的长期保存也是一个需要时间探索的挑战。

编辑: 陆美凤

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