3D生物打印技术在口腔颌面部骨组织缺损修复的研究进展

2018-11-28 10:11 来源:中国口腔颌面外科杂志
作者:陈旭卓 周知航 郑吉驷 张善勇 杨驰阅读量:2813

    各种致病因素如创伤、先天畸形、感染、肿瘤等都可导致颌面部骨组织缺损及缺失,继而引起严重的面部畸形和功能障碍,在生理和心理上给患者带来巨大痛苦。骨缺损的修复治疗大致可分为3类,即自体骨移植、异体骨移植和组织工程骨移植。自体骨的骨源有限且会对机体造成二次创伤,异体骨会引起机体对其产生免疫排斥反应,同时也存在潜在的感染风险,因此自体骨移植和异体骨移植的临床应用相对局限。由于具有良好的生物相容性、生物安全性及生物功能性且兼备可降解性及诱导成骨的能力,使得组织工程来源的骨移植材料成为目前修复骨组织缺损的理想选择。

    3D生物打印利用由生物相容性材料、各种类型干细胞及生物活性因子组成的“生物墨水”,打印出具有复杂三维立体结构的功能活性组织器官,即利用具有多分化潜能的细胞打印出适合移植的组织或器官。本文就生物打印技术在口腔颌面部骨缺损修复的研究进展进行综述。

    1. 3D生物打印技术

    1.1 3D生物打印技术的历史与发展

    3D打印技术又称为叠层制造技术(additive manufacturing),由Hull于1986年首次提出。3D打印技术最早应用于工业制造领域,立体光固化成型(stereo lithography appearance,SLA)是3D打印的重要技术之一,该技术将特定波长和强度的激光照射到光固化材料表面,使单个层面的材料发生凝固,再通过升降台的上下运动固化另一个层面,经过上述步骤层层固化,从而叠加形成一个三维实体结构。立体光固化技术后被广泛用于模型外科领域,即术前制作三维树脂模型以模拟和设计手术方案。简言之,3D打印的过程犹如CT或MRI成像的逆过程,将各个平面的断层图像堆积叠加,最终形成三维的实体结构。

    3D打印技术在医学领域首次应用于1990年,当时开发者运用CT获取的颅骨解剖数据,通过立体光固化成型,成功打印出颅骨模型,并用于临床手术的导航和设计中。21世纪初期,以打印组织器官为目的的3D生物打印技术应运而生。3D生物打印基于传统3D打印的基本原理,以活细胞为原料,构建相应组织和器官,是一类新兴的组织工程技术。对于细胞的研究尤其是干细胞领域的研究以及新型生物材料的研发,是3D生物打印技术不断取得突破的关键。近年来,对3D生物打印技术的研究主要集中于能否在宏观和微观上创建一个适合细胞生长的生物微环境,这需要细胞生物学、微流体学、生物材料学等多学科发展才能得以解决。

    1.2 3D生物打印技术的主要种类

    3D生物打印技术按照其工作原理分为以下3种:喷墨生物打印(inkjet based bio-printing)、微挤压式生物打印(pressure assisted bio-printing)和激光辅助式生物打印(laser assisted bio-printing)。在组织器官的重建方面,这三类打印系统各有优缺点。

    1.2.1喷墨生物打印

    喷墨打印机是目前最常见的打印机类型,根据动力来源不同,可分为热喷墨和声控喷墨2种。其工作原理类似于普通的2D打印机,且多由2D打印机改造而来。由生物材料和相应细胞成分组成的生物墨水取代了传统的油墨,通过打印机喷头在垂直方向上运动,打印出三维实体结构。热喷墨打印机的工作起始于对打印机喷头进行电加热,此后,液滴因压力脉冲而离开喷头至基板上,层层堆积,最终实现三维空间的构建。打印速度快、成本低、应用广泛,使用便捷是其相比于另外2种打印方法的优势所在,但细胞和生物材料在打印过程中需要承受较大的热和机械应力,同时存在喷头堵塞、细胞密度不理想和液滴尺寸难以控制等缺点,限制了此项技术在生物打印领域的应用。

    声控喷墨打印机通过调整超声波场的系列参数,精细调节液滴大小及滴落速率,液滴因超声波场力的作用从气液界面喷出。其优点在于不仅消除了机械压力和高温对生物原料的损伤,同时对液滴大小进行精确控制,从而避免了喷口堵塞。但是,该项技术对打印材料的黏度有较高的要求。

    1.2.2微挤压式生物打印

    微挤压式打印机的原料并不局限于液滴状的细胞聚合物,凝胶样细胞团块是其应用的主要形式。其基本原理是通过气动压力或活塞的机械驱动力,将打印原料以连续的细丝状从微小的针状喷头中挤出,层层堆积在打印基板上,最终形成三维结构。相比于喷墨式打印机,微挤压式打印可利用的生物材料更加广泛,故具有更加多样的生物交联机制。同时,打印环境具有较为适宜的温度,避免了持续高温对细胞活性的影响。以细胞球体作为基本的打印单位,确保了打印区域较高的细胞密度,也实现了不同种类细胞的均匀分布。该项技术的不足之处也十分明显,即不甚理想的打印分辨率以及较低的细胞生存率。因此,提高打印分辨率及改善细胞存活率,是微挤压成形生物打印技术面临的重大挑战。

    1.2.3激光辅助生物打印(LAB)

    激光辅助生物打印机的价格显著高于其他2种打印系统。其工作流程为将激光聚焦于一种吸收性底物,底物吸收激光的过程可为生物材料的打印提供驱动力,底物因吸收激光获得驱动力并将生物材料挤压出打印喷口。LAB较其他类型打印技术的优势在于,喷头为开放式结构,同时对细胞的伤害较小,细胞存活率可达95%以上,具有良好的生物安全性,确保了理想的细胞活性。高分辨率和较高的打印精度也是其他2种技术所不具备的。缺点是价格昂贵、打印耗时长及潜在的金属感染风险。

    2. 3D生物打印技术在口腔颌面部骨缺损修复中的应用

    2.1生物支架材料

    支架材料作为生物打印中的人工细胞外基质,可为细胞提供足够的支撑。这类生物材料能够为种子细胞的增殖和分化提供一个稳定的框架和平台,并且在一定程度上引导和促进组织器官的再生。组织工程中理想的生物支架材料应具有以下特点:①一定的骨诱导性和传导性;②可塑性和结构稳定性;③良好的生物相容性和生物安全性;④生物可降解性;⑤适宜的孔隙率;⑥良好的弹性模量;⑦从工业生产角度来说,应取材便利,价格经济,具有良好的性价比。目前常用的生物支架材料简介如下。

    2.1.1天然高分子材料

    天然高分子聚合物通常提取于动植物,包括胶原、葡聚糖、甲壳素、壳聚糖、脱钙骨基质、明胶、透明质酸和海藻酸盐等。3D生物打印应用天然高分子聚合物的优势在于与人细胞外基质较为相似,拥有稳定的生物活性,具有一定的抑制炎症的作用。同时,该类材料的降解产物易被吸收,利于组织再生。材料的机械强度较差,降解速度难以调节,因此一般不单独作为支架材料。胶原作为初期骨化前骨基质的主要成分,具有良好的生物相容性和降解性,不具有免疫原性及细胞毒性,但机械强度较差。Maraldi等在体外将牙髓干细胞植入胶原中,构建细胞-支架复合物,并将该复合结构移植入大鼠顶骨大面积缺损处,8周后对新生成的骨组织进行免疫荧光和组织学切片检查和分析,结果显示,胶原与相应的干细胞结合,能有效促进缺损处的骨再生。

    2.1.2人工合成有机高分子材料

    人工合成高分子材料具有骨组织工程所需的结构多样性和形态灵活性,主要包括聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)和聚乙酸内酯(polycaprolactone,PCL)等。由于具有良好的生物相容性、可塑性及可代谢性,广泛用于骨组织和软骨组织的再生与修复。但PLA和PGA存在一些明显的缺点,如降解速度过快,导致骨组织移植早期失败;同时,降解所得的酸性产物可导致机体发生无菌性炎症。

    2.1.3人工合成无机材料

    包括羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)、β磷酸三钙(β-tricalciumphosphate,β-TCP)和生物陶瓷等。此类材料广泛存在于生物骨组织,并具有类似人骨的微孔结构,从而有利于重建组织的再血管化。在口腔颌面骨组织修复,尤其是牙槽嵴重建及种植区骨增量中,应用较多。但这种材料也存在一些自身不足,如机械抗性差,降解时间过长以及孔隙尺寸难以控制等。对于黏膜支持式修复体,较低的吸收率和生物降解率并不影响修复效果,但在术区余留下过量骨移植材料,可能会影响种植体的骨结合率。因此,常将HA与其他材料复合,取长补短,充分发挥其应用价值。

    2.1.4复合材料

    单一类型的支架材料因其固有的缺陷,很难作为理想的骨组织工程支架材料。复合材料在力学强度、细胞附着性能、降解速率、骨传导性和骨诱导性方面都有很大优势,例如以PLA、PGA为代表的有机高分子材料与HA或TCP复合,可增加材料的降解时间,改善支架的机械性能。由胶原和HA组成的复合材料克服了机械强度的限制,同时获得了刺激间充质干细胞分化的特性。在临床应用方面,Khojasteh等将β磷酸三钙结合聚乙酸内酯(PCL-TCP)作为复合支架,植入比格犬骨髓间充质干细胞,成功修复下颌骨大面积垂直向骨缺损,证实PCL-TCP复合支架材料对颌面部骨组织再生有着良好的引导和刺激作用。

    2.2细胞成分

    骨组织工程的细胞成分包括已分化的成骨细胞以及各类干细胞。成骨细胞的成骨能力较强,但是缺乏在体外继续增殖分化的能力。在体外环境下,由于细胞生物微环境的改变,使其分泌功能严重减弱,难以长期存活,再加上取材部位相对局限,故高分化的成骨细胞不适合直接用于骨组织的构建。干细胞是一类未分化且具有强大分化和增殖功能的细胞。根据分化能力不同,可分为全能干细胞和多能干细胞;根据发育阶段不同,可分为:胚胎干细胞和成体干细胞。

    胚胎干细胞来自于囊胚的内细胞团,具有强大的增殖能力和多向分化功能,可被诱导分化为几乎所有的细胞类型。而成体干细胞存在于人体不同的组织,如骨髓、脂肪组织、外周血、脐带血、滑膜及牙组织等,这些细胞能在缺损处分化为特异的细胞,并促进各种生长因子更好地作用于缺损区域。伦理和技术上的诸多因素,使成体的多能干细胞在组织工程的应用远多于胚胎干细胞。

    间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因具有优异的自我更新与增殖分化能力,拥有一定的旁分泌功能而具有潜在的治疗作用,逐渐成为干细胞领域的研究热点。目前口腔中发现的间充质干细胞包括牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)、脱离乳牙干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)、牙囊干细胞(dental follicle progenitor stem cells,DFPCs)和根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)等。其中,牙髓干细胞具有来源丰富、取材方便、免疫排斥反应小等优点。

    Wongsupa等将DPSCs植入聚乙酸内酯-双相磷酸钙(polycaprolactone-biphasic calcium phosphate,PCL-BCP)复合支架材料中,修复家兔缺损的颅骨,证实DPSCs与复合支架材料相结合,具有良好的生物结合率和生物相容性,DPSCs具有良好的细胞增殖率和存活率,修复再生效果十分理想。

    2.3生物诱导因子

    生长因子是一类具有众多功能的多肽或类固醇激素的总称,在调节生物微环境及随后的细胞反应中起着重要作用。生长因子具有促细胞增殖、分化、趋化和刺激血管化等多方面作用,其中包括一些骨诱导因子如骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、胰岛素样生长因子(insulin like growth factor,IGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF-2)和血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)等,在骨组织工程中能够诱导间充质干细胞的增殖和分化。

    Moon等认为,BMP2能够促进间充质干细胞分化为成骨细胞。同样,在血运丰富的口腔颌面部,成血管肽的一些生长因子(PDGF、VEGF、FGF-2、TGF-β)在新生组织中也起着关键作用。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对于间充质干细胞的增殖分化十分关键,可改变其生物特性并促进其分化为成骨细胞。生长因子应用的主要挑战在于,能否在恰当的部位和时机将其释放入缺损部位的组织内,使组织再生效率达到最大。

    3.生物打印技术在口腔颌面缺损重建领域的发展趋势及挑战

    3D生物打印不仅可用于器官移植和组织再生,还可用于临床前药物测试、生物学制剂筛选和毒理学机制的分析等研究。理想的生物打印技术应具备以下条件:①对打印材料具有广泛的兼容性,材料选择较为灵活;②能有效对打印材料进行无菌过滤,防止机体产生免疫或炎症反应;③对不同种类的细胞及生物因子有较高的分辨能力;④能在细胞间建立广泛连接,刺激细胞间的相互作用;⑤能有效控制材料的黏度及液滴大小,有较高的打印精度。

    近年来,3D生物打印技术为代表的口腔颌面部骨组织工程技术在颌骨及牙槽骨缺损修复、种植区内骨增量、牙周病所致牙槽骨吸收的修复再生等领域的基础研究已取得了较大进展,生物打印技术可对临床上中、小尺寸的骨缺损进行较为有效的修复再生。而对口腔颌面部在范围较大的骨组织缺损,能否构建大块血管化组织工程骨进行修复;仍然是目前所面临的挑战。

编辑: 陆美凤

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