头颈部鳞癌可根据病理分型采用手术治疗、放射治疗、化学治疗或综合序列治疗。目前，手术仍是治疗口腔鳞癌的主要方法。手术时，必须对恶性肿瘤完全、彻底的切除，若切除不彻底，容易复发，再次手术常常难以获得满意的疗效。多数研究把肿瘤充分切除定义为手术切除的边界距离肿瘤浸润范围≥5mm。在常规的手术中常通过医生视诊和触诊确定肿瘤浸润和颈淋巴结转移的范围，但由于此方法精准与否高度依赖操作者的经验，常导致肿瘤边缘切除不充分，严重影响患者预后。
Loree报道了398例口腔癌患者，边缘切除不彻底与边缘切除彻底的患者相比，局部复发率分别为30%和18%，5年生存率分别为52%和60%。超声、磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）和正电子发射断层扫描（PET）的发展使得医生能够更精确地筛选出患者的癌症和局部病变，并能通过非侵入性的方法监测患者对治疗的反应。然而，目前还存在着一些不足：大多只能表现解剖结构的差异，并不能显示出肿瘤的特异性信号；在术中使用时，仅在术者停止操作时才能进行成像，无法提供实时图像；而且应用在手术室的设备体积占地大、价格昂贵。因此，需要开发新的术中可视化技术，实时评估肿瘤的边缘，并精准指导手术切除。
近红外荧光（near-infrared fluorescence，NIRF）成像通过在术前注射荧光染料，经近红外光源激发，使得肿瘤在相应区域呈现荧光，可以在术中提供实时图像区分健康和肿瘤组织从而引导手术的进行。本文就近红外荧光成像以及其在头颈部肿瘤手术治疗中的应用进展作一综述。
1.NIRF光谱
光在组织中的吸收主要取决于组织的向异性、折射系数以及对光的散射。在活体组织，血红蛋白、水和脂质都是强吸光物质。血红蛋白能吸收波长小于600nm的可见光，水和脂质能吸收波长大于900nm的可见光，介于两者之间波长（650～900nm）的光称之为近红外荧光，在此范围内散射光和非特异性的自体荧光最少，保证了组织穿透力，适合用于动物活体体内荧光成像。
2.常用NIRF染料
吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）是一种水溶性阴离子，分子量为776Da，可与人体内的血浆蛋白迅速结合，最先由柯达实验室于1955年合成。它是目前唯一被美国食品药品管理总局（Food and Drug Administration，FDA）批准应用于口腔头颈肿瘤手术治疗的NIRF成像试剂。ICG使用非常安全，半衰期很短，在150～180秒之间，可被肝脏代谢清除，发生过敏反应的比例很低（1∶10000）；其激发峰位于780nm，发射峰位于820nm，此范围在NIRF的光谱中。ICG与血红蛋白结合后，通过高通透性和滞留（enhanced permeability and retention effect，EPR）效应在肿瘤细胞中积聚，其不具有肿瘤靶向性。
EPR效应的定义是由于肿瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子类物质和脂质颗粒具有选择性高通透性和滞留性。在近红外荧光成像中使用低浓度的ICG可精确定位前哨淋巴结（SLN），灵敏度较高，从而可减小手术切口，缩短手术时间。
3.NIRF染料偶联肿瘤靶向配体
显像试剂的肿瘤靶向性对于肿瘤检测的特异性和敏感性非常重要。通常NIRF染料需要通过与肿瘤特异性配体的结合来实现对肿瘤的主动靶向性。例如头颈部肿瘤的化疗药物西妥昔单抗（Cetuximab）和帕尼单抗（Panitumumab），可以靶向结合肿瘤细胞表面的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR），与荧光染料相偶联，对肿瘤进行特异性成像。Kristine等发现虽然在体外鳞癌细胞中Panitumumab-IRDye800 CW的荧光强度比Cetuximab-IRDye800 CW要高，但是在原位舌癌的小鼠模型中二者并没有显著差异，都可以用于荧光引导肿瘤手术。
随后，Zinn等报道了在动物中静脉注射Cetuximab-IRDye800没有明显的毒副作用，较为安全。然而，这种通过NIRF染料与肿瘤靶向配体偶联的策略依然存在一定的问题，主要体现在这种化学共轭的过程可能会破坏一些NIRF染料或肿瘤靶向配体的结构，导致成像或靶向性的损耗或丧失。此外，一些化合物还可能表现为光学稳定性较差或有其它一些缺陷，限制了肿瘤成像的广泛应用。因此如何保持染料和肿瘤靶向配体结构的稳定以及靶向配体的亲和力也是未来研究的重点。
4.成像设备
荧光引导手术需要一种与荧光染料相配套的成像设备，由以下几部分构成：①可提供普通视野下观察的白光和荧光示踪剂的激发光两种光源；②可采集可见光及NIRF的光学镜头；③用于可见光的成像和NIRF成像的两种成像设备。理想的荧光引导手术设备应具备精确检测肿瘤组织、使用简单、方便在手术室中使用等特点。现有的在临床使用的成像设备只能与吲哚菁绿配套使用。对于哪种荧光成像设备更适合应用于头颈肿瘤切除术，学界尚未达成一致。目前，已开发了几组适用于实时监测IRDye800的设备，但由于研究的成本、知识产权的重叠性、尚未获得美国FDA批准等一系列问题，这些荧光引导手术设备尚未进入临床试验阶段。
5.近红外荧光成像头颈部鳞癌术中导航的应用
历史上第一台荧光引导手术可以追溯到1948年，GEORGE等神经外科医生将荧光素通过静脉注射到患者体内，以增强颅内肿瘤的影像。术中荧光成像具有对比度高、灵敏度高、成本低、无电离辐射、使用方便、安全、特异性强等优点。与采用标准白光成像相比，实时荧光成像有助于鉴别肿瘤组织和划定肿瘤边缘。
6.术前荧光成像
术前对头颈肿瘤患者进行荧光成像，可以标记原发肿瘤和侵犯的颈淋巴结位置和范围，有助于医生制定手术计划。还可以根据肿瘤中荧光染料的积累量确定最合适的荧光引导手术日期。Moore等对15名头颈肿瘤患者注射Cetuximab-IRDye800，3h后观察原发肿瘤和颈部成像，每隔2h进行1次同部位成像，直至手术当日；发现术前对头颈肿瘤进行荧光成像，能清晰地显示和标记肿瘤边界，并在皮肤上标定距离肿瘤浸润范围5mm的手术切口。
荧光成像设备在术前确定肿瘤切除范围上展现出了强大的潜力。经定量分析后发现，注射染料后的第1d，原发肿瘤荧光染料的平均积累量最高（98.5±2.04），成像最为清晰。平均肿瘤/背景比值（tumor-to-background ratio，TBR），即肿瘤细胞对荧光染料的标准摄取值（standardized uptake value，SUV）与正常细胞对荧光染料的标准摄取值之比，也在注射染料后第1d达到最高（2.78±0.0414），意味着此时染料区分肿瘤细胞和正常细胞的灵敏度达到最高。术中NIRF荧光成像能在头颈肿瘤根治切除术中提供实时成像。术者能实时评估肿瘤边缘，提高完整切除肿瘤的可能性，并减小对健康组织的损伤。
Heath等利用8例小鼠模型证明了荧光成像能在头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）切除术中辅助确定肿瘤边界，利用Pearl和SPY两种成像设备，均有较高的肿瘤/背景比值，分别达到了4.2和2.3。在其中7例手术过程中，SPY检测到了部分区域显示为高荧光，但术前视诊和触诊均并提示异常，经术后病理诊断证实为肿瘤组织。此外，两种设备均检测出了颈淋巴结转移，在术前进行的检查中并未发现。
Rosenthal等将12名头颈肿瘤患者分为3组，分别注射浓度为2.5mg/m2、25mg/m2、62.5mg/m2的Cetuximab-IRDye800荧光染料。注射第4d后，应用开放设备在术中进行NIRF成像观察。对手术中切除的原发肿瘤组织大体标本（4～5mm厚）进行封闭荧光成像，肿瘤组织发出高强度的红色荧光，可清晰地显示肿瘤边界。与病理学确定肿瘤边界结果一致，说明应用Cetuximab-IRDye800进行荧光成像对判断头颈肿瘤的边界有较高的准确性。
此实验所用染料Cetuximab的分子作用靶点为细胞表面的EGFR，首次证实了肿瘤细胞内过度表达的EGFR可以安全地用于诊断成像，这种靶向方法可以产生显著的肿瘤/背景比值，有助于手术医生判断肿瘤边界。还首次证实了被荧光标记的治疗性单克隆抗体可被用于临床上识别肿瘤组织，为未来研发更安全、敏感性更高的荧光染料提供新的思路。术中应用宽视场设备进行荧光成像，静脉注射浓度为62.5mg/m2的cetuximab-IRDye800的患者，平均肿瘤/背景比值为5.2。在注射染料后的3～4d，可以观察到肿瘤/背景比值逐渐升高，提示手术医生注射染料与实施手术应间隔几天，以便达到肿瘤/背景比值的峰值，这与Moore所做的研究结果也一致。
Gao等将21名头颈肿瘤患者分为4组，术前1～5d注射荧光染料。前三组分别注射浓度为0.06mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg的panitumumab-IRDye800 CW，第四组注射50mg的panitumumab-IRDye800 CW。在手术过程中，应用开放成像装置获得实时原位荧光成像，并在手术标本切除后立即用封闭成像装置荧光成像。术中应用开放设备成像的TBR为2～3，而应用封闭设备成像的TBR为5～6。
经分析，导致TBR差异的原因主要是开放的现场设备会受环境光、反射和设备相对肿瘤的位置的影响，而手术标本的背向成像可以利用封闭的现场设备，具有标准且可控的环境。这提示在目前的技术水平，应用封闭设备都原发肿瘤标本进行成像比术中应用开放设备成像更为可靠。研究人员以病理学家对标本的HE染色结果作为标准，对每位受试者的标本和计算得到平均荧光强度，分别进行ROC曲线（receiver operating characteristic curve，ROCcurve）分析。
与凭借视诊和触诊进行手术操作的外科医生相比，荧光信号更精准地显示了肿瘤组织的存在：具有很高的敏感性（100%比36%）和阴性预测值（100%比84%），但是特异性（74%比97%）和阳性预测值（52%比80%）相对较低。基于以上数据，临床团队可将术中荧光成像作为一种理想的排除试验，便于筛选标本并排序，以便进一步检查，从而节省大量时间成本和劳动成本。荧光成像系统还可以辅助应用于头颈肿瘤患者术中前哨淋巴结（sentinel lymphnode，SLN）定位。SLN作为阻止肿瘤细胞从淋巴道扩散的屏障，可以准确反映整个淋巴结群的状态。若SLN没有肿瘤转移，那么其他淋巴结在理论上也应该是阴性。同样，若SLN有肿瘤组织浸润，第二、三站甚至更远的淋巴结也存在肿瘤转移的风险。
Vorst等对10名头颈肿瘤患者（包括9例鳞癌和1例基底细胞腺癌）进行颈阔肌翻瓣后，静脉注射预混合的ICG和人血清蛋白（human serumal bumin，HSA）1.6mL，在注射后5、10、15、20、25、30、45和60min分别对SLN进行荧光成像；其中7名患者，在注射5min后即观察到了SLN的图像。其余3名患者，分别在10、15和30min后观察到了SLN。淋巴结与周围组织的荧光信号的平均对比度为8.7±6.4。其中有3例患者各出现了1个假阴性的淋巴结，经病理诊断后确诊为转移灶。
研究者分析假阴性结果可能的原因包括：颈部淋巴结交通支丰富，如导管被栓塞可能引起淋巴引流改变方向，使有转移的SLN不能被成像；当前使用的设备灵敏度较低；或出现了跳跃性的淋巴结转移。柳贞等总结了荧光示踪法探测SLN的优势：①荧光示踪法可以实现体外探测，并可探测到位置较深的SLN；②许多具有荧光的有机示踪剂同时具有染料的特性，可以在荧光探测的同时在可见光下进行观察，实现双重定位；③荧光示踪法的示踪剂对人体的危害较小。
术后病理学家也可以利用NIRF荧光成像对手术后的原发灶标本进行观察，并与HE染色进行比较分析，进行术后的综合预后评估。Heath等将注射了panitumumab-IRDye800的小鼠的舌癌病理组织切片用Odyssey扫描仪进行显微荧光观察，分辨率可达200μm。高荧光强度的区域与经HE染色后确定的肿瘤组织浸润区域相吻合，说明荧光成像可以用于辅助病理诊断，改进术后评估方式，提高鉴别隐匿性病变的能力。
Moore等报道的3例口腔癌（硬腭和侧舌）荧光引导手术中，原位观察到每个病灶的荧光强度明显小于（减少了87%）同部位的病理大体标本术后体外成像的荧光强度（P＜0.05）。此外，还发现原位荧光图像的对比度与体外成像的对比度相比有所下降。该技术近红外荧光的穿透深度只能达到大约5mm。该深度可以识别小范围样本中的肿瘤组织，并且可以确定切除的组织与肿瘤组织之间的距离，但不能提供厚度大于10mm的样本的完整内部图像。
7.荧光成像不足
光学成像还有一些固有限制。首先，荧光信号的强度会随距离的变化而变化。其次，在两个组织平面的交界处，会由于两种组织荧光的叠加效应而产生伪影。经研究发现，可以通过动态荧光成像，虽然非癌症区的荧光强度会随着摄像机角度的改变而有所波动，不管摄像机位置如何，主病灶的荧光强度几乎保持不变，以此来区分真实信号和伪影。
8.结语
荧光成像设备可为头颈肿瘤外科医生提供非常有价值的辅助。该装置可用于术前定位肿瘤和前哨淋巴结；通过每日成像来确定最佳的手术时机；在术中也可用于实时确定肿瘤边界，指导肿瘤切除手术；并用于术后隐匿性或可疑浅表病变的检测和评估。但荧光引导头颈肿瘤手术面临术中的切除范围该如何界定和荧光阳性的组织是否应该全部切除的难题。目前每种荧光成像设备都只能与相应的荧光染料配对使用，因此，探索利用单一设备来成像多种荧光染料，将会是当下的研究热点。
