间充质干细胞相关生长因子在牙槽骨修复的应用进展

2019-7-3 15:07  来源:口腔医学
作者:金晓明 陶海彪 江银华 阅读量:1795

    牙槽骨缺损修复是口腔颌面外科常见棘手问题。牙槽骨缺损的原因主要有颌面部创伤、肿瘤、感染性疾病和骨骼的异常发育,除功能障碍外,还会导致患者的美学缺陷和心理创伤。治疗牙槽骨缺损的目的是恢复牙槽骨的正常形态,以利于后期种植修复,恢复口腔功能。

    目前临床中常用的骨缺损修复技术有牵张成骨术、生物材料移植等,能够有效解决口腔种植手术中部分骨量不足的问题。尽管骨缺损修复方法一直在改善,但大多数临床医师及研究人员仍然认为自体骨移植是骨修复的“金标准”。这是因为自体骨不存在免疫原性,并且包含了有效诱导组织再生所需的所有元素,包括骨原细胞、细胞因子和细胞外基质,提供理想的骨移植物所需的经典三元素:成骨、骨传导和骨诱导。

    自体骨移植限制条件较多,包括手术费用高,手术时间长,受到患者年龄及代谢影响。临床中已有各类外源性替代物应用,包括同种异体骨、异种骨和异体材料。此类替代物成骨和骨诱导性相对自体骨较差,术后感染几率高,限制其应用。故基于基因治疗、干细胞治疗和骨诱导生长因子等组织工程学技术来加快骨缺损后的修复,具有较好前景。

    1.牙槽骨修复的生理过程

    骨修复的生理过程涉及细胞、生长因子和细胞外基质的协调作用。损伤后局部即发生炎性反应,造血和间充质干细胞移至损伤部位,形成新的血管网络、软组织基质、软骨,最终诱导成熟的骨组织形成。损伤部位的皮质骨、骨膜、骨髓和外部软组织在愈合过程中受到相关因素影响,如生长因子、激素、营养物质、pH值、机械稳定性等。

    1.1炎症阶段

    一般在12~14h内开始,在24h内达到峰值,并在损伤后约7d完成。其特点在于具有破坏性、局部炎症反应和缺氧。受损伤后首先到达损伤部位的细胞是嗜中性粒细胞,随后是巨噬细胞和淋巴细胞。巨噬细胞不仅吞噬坏死组织,而且释放出许多能刺激骨损伤愈合的生长因子和细胞因子。

    1.2增殖阶段

    其特征在于形成新的血管,并将血栓重组成肉芽组织,然后将其在提供骨样支架的软组织中浓缩,矿化后作为结构稳定的模板。根据骨的类型、骨损伤类型、组织形态结构及固定方法,骨愈合可分为两种形式:①原发性愈合,其中成骨细胞分泌骨样基质用于未来的矿化(膜内骨化);②继发性愈合,通过软骨细胞产生软骨基质,并被随后矿化(软骨内骨化)的骨样基质取代。

    牙槽骨与长骨分属两种愈合方式:前者主要为膜内骨化,在成骨位置,出现血管增生,部分间充质细胞直接分化为成骨细胞,产生的骨基质被包埋于基质中逐渐转化为骨细胞,同时矿化,形成早期骨组织;后者多见于四肢骨,多为软骨内骨化,其过程是来自中胚层的间充质细胞聚集,在转录因子SOX9的作用下分化成软骨细胞,待血管渗入骨膜并侵入软骨支架,产生一级骨化中心,后血管和骨原细胞进入骨干两侧富含软骨的基质,形成二级骨化中心,出现骺板,骨重建完成。在两种愈合形式中,损伤部位的血管已被确定为影响愈合过程的重要因素之一,只有组织充分血管化,骨形成才能成功进行,因此,血管生成是骨修复过程中除骨诱导外的关键组成部分。

    新生血管允许携带氧气和营养物质,能进行气体交换和废物排出,可以作为炎性细胞、软骨细胞和骨前体细胞的通路,新生血管形成血管网,能够促进骨愈合过程。血管形成对于膜内成骨和软骨内成骨是必需的。在软骨内骨形成期间,因其血管环境改变,可允许成骨细胞、软骨细胞和骨祖细胞生长,将新骨沉积在软骨表面。在膜内骨化过程中,也需要血管化来允许骨祖细胞、骨原细胞的到达。VEGF、BMP、TGF-β、FGF和血管生成素-1、血管生成素-2等促血管生成因子能够刺激血管内皮细胞的血管生成和迁移。

    1.3重塑阶段

    第三阶段称作骨重塑阶段,时间从几个月到几年,其主要目的是重塑骨骼,以恢复其原有的结构和功能。在此阶段,破骨细胞受到TNF-α、TGF、BMPs等生长因子的刺激,重新吸收并形成骨组织。成骨细胞在新生骨中有更多的类骨质和磷酸钙沉积,增加了矿化基质的密度。因此,骨的横向直径减小,但内部结构的密度越来越接近于完整骨的结构。随着这一阶段的不断发展,细胞数量逐渐减少,骨密度增加。

    2.牙槽骨修复的间充质干细胞疗法

    骨组织缺损的临床定义为因创伤、先天畸形或外科手术引起的骨的完整性破坏。骨缺损临界尺寸是指患者不能自发再生的骨缺损,需要外科手术进行恢复。组织工程和再生医学的目的是重建骨组织的再生愈合过程,能够满足超过临界尺寸的骨缺损愈合的生物力学参数的骨再生治疗。目前已有研究基于细胞增殖分化的骨缺损再生疗法。与骨组织重建相关的细胞类型包括成骨细胞、胚胎干细胞、骨祖细胞和间充质干细胞。

    间充质干细胞(mesenchmal stem cells,MSC)被定义为能够自我更新和分化成各种专门类型的间充质细胞,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、成纤维细胞的多能干细胞,在包括心脏、免疫系统、肝脏、肾脏和骨骼等损伤组织修复再生中都有巨大的治疗潜力,已被证明是细胞治疗的最佳选择之一,几乎可以从所有的血管化组织中分离出来。以往认为临床应用MSC是基于其作为种子细胞大量植入或注射于损伤部位,发生定植分化。然而,越来越多的文献报告称,即使MSC可见一定的治疗效果,但植入的MSC细胞若不分化则无法长时间生存。而旁分泌效应认为MSC有化学趋化作用,MSC分泌一定的生物趋化因子来抑制纤维化、细胞凋亡和炎症,诱导组织细胞增殖分化,促进血管发生和组织再生,从而促进创伤组织的修复。

    MSC除具备干细胞的多分化潜能外,还拥有特殊的低免疫原性和免疫调节能力,这种调节能力可以存在于外周免疫耐受、移植耐受、自身免疫、肿瘤逃避中。这很大程度上归因于MSC低水平表达人类白细胞抗原和主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)。MSC能对体内的炎症损伤部位作出响应并迁移到对应位置,通过与固有和获得性免疫系统相互作用调节相关效应器的功能,并参与组织修复和炎症调节。炎症刺激条件下,MSC通过分泌TGF-β、HGF等多种蛋白因子,防止细胞或体液免疫中的T淋巴细胞或B淋巴细胞不适当活化,并在创伤修复过程中产生耐受环境。因此,MSC可以在炎症组织内发挥免疫调节的作用,在牙槽骨修复中具有广阔的应用前景。MSC增强骨组织修复过程的机制是复杂的,因为它们可以参与骨愈合的3个阶段:炎症、增殖和重塑。

    Crisan等提出了MSC与血管周围细胞之间的关系,不管其组织来源如何,血管周围细胞都具有表现出成骨、软骨形成和脂肪形成的潜力,并表达MSC标志。Caplan认为所有MSC都是血管周围细胞,解释了MSC能够在所有血管化组织中存在。当损伤破坏血管的正常结构时,血管周围细胞被激活,产生MSC,通过分泌细胞因子控制内源性炎症反应,促进血管生成并刺激祖细胞增殖和分化,促进组织修复。文献报道显示,即使可以观察到治疗效果,植入的MSC细胞也不会长期保持分化能力,且无法长期存活。在急性心肌梗死的动物模型中,确定植入的MSC不能存活,移植后1~2周只能接受移植MSC的4.4%,MSC移植模型大鼠的脊髓损伤显示植入物在1~2周后从宿主中消失。

    也有报道称,人类脂肪组织来源的MSC可以有效地诱导兔子的骨骼再生,但是在植入部位,它们不会分化并且不能够存活超过12d。最近的研究证明,MSC的许多治疗作用可以通过生长因子的分泌来介导,从而开启了在某些情况下直接施用这些介质以取代细胞使用的可能性。据此,Caplan提出,决定其治疗潜力的MSC的最重要特征不是它们的干细胞,而是分泌大量生长因子的能力,并主张将MSC名称改为药物信号细胞,以更准确地反映这些细胞定植在损伤部位分泌生物活性因子,发挥免疫调节和组织再生的类似药物的作用。

    3.牙槽骨修复相关的生长因子及其生物学意义

    Meirelles等在体外培养MSC时发现,脂肪组织来源的间充质干细胞都有表达肝细胞生长因子,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),转化生长因子β(TGFβ)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的能力,而在低氧培养条件下这些分子的表达能力增强,特别是低氧条件下VEGF的表达量增加已被证明大于其他因素。Liang等发现胎盘MSC能够促进糖尿病下肢缺血小鼠血管新生,MSC除能够直接形成血管内皮细胞外,还能够分泌促血管新生因子,如血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)。

    Meirelles提出的实验模型显示MSC在组织修复中发挥积极的作用,根据模型,局灶性损伤导致局部细胞死亡,炎症细胞迁移到破坏区;MSC被激活分泌不同的生物活性分子,进行损伤修复,包括IL-1β、TNF-α、VCAM-1、VEGF、bFGF、甲状腺刺激促甲状腺激素(TSH)等。

    3.1转化生长因子-β(TGF-β)超家族

    TGF-β家族是近年来研究最广泛的生长因子。该家族包括TGF-β、骨形态发生蛋白(BMP)和生长分化因子(GDFs)等,其参与在骨形态发生过程中导致间充质前体形成的复杂过程。它们来自高分子量前体,并被蛋白水解酶活化,对靶细胞上的丝氨酸、苏氨酸激酶膜受体起作用。这种配体-受体相互作用激活细胞内信号通路,最终影响细胞核中的基因表达。

    3.1.1骨形态发生蛋白(BMP)

    BMPs是TGF-β超家族中独特的蛋白质家族,在调节形成、维持和骨修复中起重要作用。在骨组织中,BMP由骨祖细胞、成骨细胞、软骨细胞和血小板产生,其调节作用取决于靶细胞、分化阶段、局部浓度以及与其他分泌蛋白的相互作用。BMPs能够诱导软骨形成、成骨、血管生成和细胞外基质合成。大量的临床前研究表明,骨形态发生蛋白能够诱导缺损部位的骨形成,并促进临界尺寸缺损愈合。

    目前已经确定BMP-2、BMP-4、BMP-7在骨骼细胞的迁移、缩合、增殖和凋亡过程中起重要作用。另有报道称,BMP-4和BMP-7负责诱导神经嵴细胞,而BMP-2主要参与软骨内和骨膜内骨化形成未成熟骨结构之前出现的间充质细胞的缩合。BMP-4在损伤后的第1~5天最活跃。BMP-2在骨再生过程中是一直具有活性的,最终导致骨重塑成层状和横切骨组织,而BMP-7主要活跃于损伤第14天后。BMP的靶细胞包括MSC、骨髓细胞、成骨细胞、成肌细胞、成纤维细胞和神经元细胞。对成骨细胞和骨膜细胞的一般影响涉及DNA和参与骨基质蛋白合成的基因转录活性增加。

    3.1.2转化生长因子-β(TGF-β)

    TGF-β有5种异构体,具有调节细胞增殖、凋亡、分化和迁移的功能。TGF-β由成骨细胞和软骨细胞产生,并且被存储在骨基质中。TGF-β能够被血小板和TGF-β1释放,是人类血小板家族中的第一个成员,在愈合过程中可能发挥作用。从骨损伤引起炎症的初始阶段,血小板释放TGF-β,证明其参与了初始损伤组织的形成阶段。TGF-β是一种多功能分泌蛋白,在细胞中具有不同的功能,如控制细胞生长和增殖,分化及凋亡。TGF-β诱导MSC、前成骨细胞、成骨细胞和软骨细胞的增殖,并刺激细胞外生成的蛋白质,如胶原蛋白、蛋白聚糖、骨桥蛋白、骨粘连蛋白和碱性磷酸酶。TGF-β是MSC的有效趋化剂,在软骨形成和软骨内骨形成过程中,通过骨祖细胞诱导BMP的合成,抑制破骨细胞活化并促进其凋亡。

    3.2血小板衍生生长因子(PDGF)

    血小板衍生生长因子对MSC具有有效的趋化性和促有丝分裂的刺激作用,在成骨细胞分化中具有促进伤口愈合、血管生成的重要作用。PDGF家族包括4种同种型:PDGF-A、PDGF-B以及最近发现的PDGF-C、PDGF-D。PDGF-A/B形成同型二聚体(AA或BB)和异二聚体(AB)。PDGF-AB和PDGF-BB是在α血小板颗粒中循环的变体,当血小板结合到损伤部位时释放。PDGF-BB变体在受损区域的细胞有丝分裂和趋化性中具有积极作用,并在骨再生中起关键作用。在骨损伤后,PDGF被巨噬细胞和血小板释放,并且作为间充质谱系,动员成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞和免疫系统细胞的有效诱导剂和有丝分裂因子。PDGF在损伤后的前72h内是有活性的,并且作为血管生成的启动子在骨缺损的血运重建中起重要作用。

    3.3成纤维细胞生长因子(FGF)

    成纤维细胞生长因子由9个结构相关的多肽构成,对骨祖细胞具有有效的促有丝分裂作用。它们是最初由其刺激细胞增殖能力确定的生长因子。在骨愈合过程中,它们可以在骨折愈合早期由单核细胞、巨噬细胞、间充质细胞、成骨细胞和软骨细胞分泌。FGF家族成员存在于损伤部位长达3个星期,其主要活性是刺激内皮细胞迁移和血管生成的后续和间充质细胞有丝分裂。酸性(aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是正常人组织中最丰富的生长因子,aFGF主要影响软骨细胞增殖,对于软骨细胞成熟可能是重要的,而bFGF由成骨细胞表达,通常被认为是aFGF的有效促分裂原。在犬胫骨截骨模型中,单次注射bFGF可促进损伤组织早期愈合。

    3.4血管内皮生长因子(VEGF)

    骨缺损愈合过程中的血管生成调控具有两个独立的途径:VEGF依赖性途径和血管生成素依赖性通路。VEGF是有效的血管生成因子,不仅能增加内皮细胞的增殖分化,也能增加内皮祖细胞的活性聚集。目前研究表明VEGF和BMP具有协同作用,VEGF本身不能促进骨再生,而是与BMP协调起作用,以增加MSC向缺损部位的集中,并诱导成骨细胞的积极分化。VEGF主要表达于损伤后的14~21d,因此,它早期就参与了骨的矿化和再生重塑。

    3.5胰岛素样生长因子(IGF)

    IGF-1/2在胚胎发生的第一阶段刺激器官发生和生长,调节后期发育阶段特定组织和器官的功能。其来源主要是骨基质、内皮细胞、成骨细胞和软骨细胞。IGF-1通过完全分化的成骨细胞促进基质形成(Ⅰ型胶原和非胶原基质蛋白),相比IGF-2更为有效。IGF-2在软骨内骨形成的后期发挥作用,刺激Ⅰ型胶原蛋白生成,软骨基质合成和细胞增殖。

    4.小结

    种子细胞、生长因子、支架材料均是骨组织工程的重要组成部分。骨组织工程支架材料对成骨细胞起支撑作用,提供良好的生物相容性,促进骨整合,从单一的无机或有机材料发展到目前热门的复合材料,如何获得既有足够机械性能并良好生物相容性的理想支架材料仍有多方面的挑战。Xu等证明了间充质干细胞体外扩增能力极强,以间充质干细胞作为种子细胞,因其低免疫原性,在植入后仍可保持良好的生物学活性,使其成为骨修复的组织工程学首选替代材料。

    MSC有效治愈能力可能是由其分泌大量生长因子所提供,口腔颌面外科临床中常见的拔牙后骨缺损、牙周病所致的骨缺损均可由MSC治疗。根据骨再生的生理过程,在特定条件下直接应用生长因子或许能加速骨缺损的恢复。目前尚罕有文献表明直接应用相关生长因子与利用MSC治疗骨修复有差异,如果单独应用相应种类的生长因子成品效果与MSC治疗一致,或者效果更优,我们期待可以简化临床应用过程。

编辑: 陆美凤

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