理想的牙周组织再生是达到牙周膜、牙槽骨和牙骨质三者的共同再生。牙槽骨和牙骨质为高度矿化的硬组织，而牙周膜则是连接两者的致密结缔组织界面，牙周膜中的胶原纤维以定向排列的形式插入并锚定在牙槽骨和牙骨质的矿化表面，形成Sharpey纤维，具有保护牙周硬组织免受咀嚼外力冲击的作用。
目前，临床中常用的牙周组织再生技术多数情况下是在牙根表面形成脆弱的长结合上皮，并未还原天然的牙周膜结构。而在长结合上皮状态下，患者若无法长期维持良好的口腔卫生和健康的牙周状况，极易再次进入牙周炎的疾病进展期。因此，如何再生牙周膜纤维，并使其稳定地锚定在牙槽骨和牙骨质内，成为现今牙周再生领域的一项巨大挑战。本文就天然牙周膜的解剖结构和发育过程、牙周膜再生技术及影响牙周膜再生的特异性因素做一综述。
1.牙周膜的解剖结构和发育过程
天然牙周膜是一层形态菲薄且结构精密的致密结缔组织，宽度仅100~350μm，主要成分为牙周膜细胞和细胞外基质。其中，牙周膜细胞是以牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament cells，PDLCs）为主，还包括成骨细胞、成牙骨质细胞、牙周膜祖细胞和牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）等。细胞外基质则以Ⅰ型胶原为主，并包含少量的Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅻ型胶原。根据空间分布的不同和排列方向的差异，牙周膜中的胶原纤维被分为5组主纤维束，其方向各异性使牙周膜得以承受各方向的咀嚼外力，然而因其结构复杂，使得再生牙周膜的难度也随之增加。
长期以来，牙周膜的发育被认为是一个同时涉及胶原矿化和纤维整合的复杂过程。首先，靠近牙骨质侧位于Hertwig上皮根鞘冠状突起内的成纤维样细胞向非矿化牙本质基质伸出胞质突，分泌最初的牙骨质基质，并形成垂直于根面的胶原纤维。后续的牙骨质基质则由牙囊来源的成牙骨质细胞产生。随后，牙骨质基质由牙本质侧向牙骨质侧进行矿化，并在牙周膜空间中留下10~20μm的胶原纤维突起，最终形成牙根与牙周膜间的Sharpey纤维连接。而牙槽骨侧Sharpey纤维的形成过程则发生在牙槽骨矿化完成之后，牙槽骨通过快速重塑的能力捕获牙周膜纤维，使其附着并嵌入骨基质中以形成牙槽骨侧的Sharpey纤维。
在随后的牙周韧带形成阶段，牙周膜空间中的PDLCs产生新的细胞外基质并在咬合力的作用下进行功能重塑，即PDLCs分泌的胶原纤维首先黏附于Sharpey纤维的胶原突起上，紧接着以横向或纵向的纤维排列方式有序地生长并扩散到牙周膜空间，最后形成从牙槽骨侧至牙骨质侧完整的纤维吻合网络结构。
2.牙周膜再生的技术
2.1组织工程技术
经典的牙周膜组织工程包含种子细胞、支架材料和生长因子三要素，其主要过程是将种子细胞在体外培养扩增，并与具有良好生物相容性和降解性能的支架材料及促进组织再生的生长因子按比例混合形成细胞-材料-生长因子复合物，随后植入机体的牙周病损区域以产生新的牙周膜样组织。牙周膜再生中较为理想的种子细胞包括PDLCs、PDLSCs、骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）、根尖周牙囊干细胞（periapical follicular stem cells，PAFSCs）等，这些细胞均具有产生细胞外胶原基质或分化为PDLCs的能力。而作为细胞载体的牙周膜组织工程支架则需适配狭小的牙周膜空间，并引导种子细胞产生胶原纤维插入并锚定在周围的矿化表面。
大量文献表明，明胶、胶原、聚己内酯（polycaprolactone，PCL）等水凝胶材料在机械性能、生物活性方面均与细胞外胶原基质高度相似，因此被大量应用于牙周膜再生研究中。同时，静电纺丝、定向冷冻及三维打印等微纳米制造技术的长足发展，使支架材料得以在不改变生物活性的前提下，精确且快速地成型，以满足牙周膜空间对支架精度的要求。此外，促成纤维和成骨的生长因子，如血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、其他骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP），以及自体富生长因子浓缩物，如富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）、浓缩生长因子（concentrate growth factors，CGF）等的加入则有效促进了种子细胞的定向分化或细胞外基质的产生及矿化，极大地提高了牙周膜组织再生的成功率和效率。
尽管如此，经典的组织工程技术仍有其局限性：大量体内实验表明，经典的细胞-材料-生长因子复合物仅诱导牙槽骨及散乱胶原纤维的再生，难以重建具有生理功能的天然牙周膜主纤维束；此外，部分外源性支架材料，如聚乳酸（PLA）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）在体内细胞黏附性较差、降解速率低，产生的降解产物常引起微环境中pH值下降，并导致无菌性炎症反应。由此得知，要达到类似天然牙周膜的组织再生目标，经典的组织工程技术仍有待大量的技术优化和生物活性材料的开发。
2.2细胞膜片和脱细胞膜片技术
细胞膜片是采用非酶解法获得完整的细胞片层，是一种新型的无支架细胞载体。膜片提供了组织结构完整的健康细胞及细胞外基质，最大程度地保留了细胞-细胞及细胞-细胞外基质间的信号传导网络，尽可能地模拟了体内局部微环境，有效地消除了外源性支架降解对局部组织造成的不良反应。这一技术在牙周组织工程中的应用已屡见不鲜。
2005年，Akizuki等首次制备了犬PDLCs复合透明质酸膜片，并通过犬牙周开裂缺损模型评估了细胞膜片的再生效果。组织学染色显示，实验组中可见新生牙骨质-牙周膜-牙槽骨组织，部分样本中甚至形成垂直插入新生牙骨质和新生牙槽骨的胶原纤维；而对照组中仅植入透明质酸膜片，所有样本中仅能观察到沿根面走形的修复性结合上皮，以上结果表明PDLCs膜片介导了以牙周膜和Sharpey纤维形成为特征的理想牙周膜再生。
随后，Vaquette等和Costa等均通过体内研究证明了细胞膜片在牙周膜再生中的促进作用。Flores等和Iwata等还制备了强度更高的复层细胞膜片，从而解决了单层细胞膜片脆性较大的问题。另外，种子细胞的增殖活性和分化潜能易受牙周微环境影响而发生改变，常导致牙周膜再生无法达到预期效果。因此，部分学者以多种细胞共培养的方式制备复合细胞膜片，通过增强膜片内细胞-细胞及细胞-基质间的交流，间接削弱微环境对细胞不可控的影响。
Chen等将根尖牙胚（apical tooth germ，ATPG）-PDLSCs复合细胞膜片植于免疫缺陷小鼠背部，成功诱导了牛骨片与牙本质片间具有嵌入性纤维的牙周膜-牙骨质样组织生成。Panduwawala等也采用类似方法证明了人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）-PDLSCs复合膜片对牙周膜再生的协同促进作用，HUVECs使小鼠体内新生牙周膜样组织的厚度增加，并促进新生组织内血管的形成及新生管腔与宿主脉管系统的吻合。
然而，临床上受到免疫原性限制，细胞膜片治疗的成功率低、安全风险大，而从细胞膜片法中衍生的脱细胞基质膜片可克服上述缺陷。Farag等通过NH4OH/TritonX-100联合DNA酶的脱细胞方法成功制备了人PDLCs来源的脱细胞膜片，并以PCL静电纺丝膜作为载体。随后的大鼠实验结果显示，脱细胞膜片组产生大量垂直插入牙根的Sharpey纤维，而单纯PCL膜组中形成的新生纤维多平行于牙根表面，提示脱细胞膜片在牙周膜再生中的巨大潜力。
综上，细胞膜片及脱细胞膜片技术有效改善了牙周局部微环境，在牙周再生中的应用前景非常可观，但其安全性和高效性仍有待后续临床试验结果证实。
2.3材料表面图案化技术
1999年，Brunette等首次就钛种植体表面微纳结构的拓扑形态对细胞行为的影响进行总结，指出种植体表面的微型沟槽结构能引导上皮细胞增殖的方向，并阻止上皮向根方迁移；在小鼠实验中，微型沟槽结构使得小鼠皮下矿化骨样结节的数目大大提升，并对其分布的方向起到引导作用。另有研究表明，细胞膜表面的黏着斑、细胞骨架和细胞核共同构成了细胞内的结构力学传导通路，辅助完成细胞外基质中多种物理信号向细胞内生物信号转化的复杂的生物学过程。
1984年，Tomasek等首次提出有序排列且方向一致的外源性胶原影响胚胎期鸟类角膜成纤维细胞的胶原合成和细胞骨架形态。基于此，部分学者专注于构建具有定向排列特征的纤维性三维引导结构，以诱导PDLCs呈现极性排列并分泌细胞外基质，从而达到牙周主纤维束结缔组织的重建。此外，Yu等发现，PDLCs能够沿着硅橡胶表面不连续的纳米级拓扑形态生长和扩散；同时，附着于光滑表面的PDLCs表达成腱相关标志物的水平较富有纹理表面的PDLCs明显增高，表明细胞附着的材料表面形态可影响PDLCs的极化、迁移和分化等多种生物学行为。
Park等已将这一特性应用于诱导牙周组织再生的多相支架中，他们首先利用计算机辅助设计制造出多相支架，随后将PDLSCs搭载入支架中并植入大鼠体内，仅6周后发现，在牙周膜单元和牙骨质单元间即有新生的牙周膜组织生成，且新生胶原纤维按照特定的方向有序排列。而后，该项目组运用同种技术将牙周膜单元进行改良，使得此结构更接近天然牙周膜结构且保证材料纤维呈定向排列，在植入大鼠牙槽骨开窗缺损区6周后，便观察到有与天然韧带角度和高度均相似的成熟纤维组织形成。
为了更精确地模拟牙周膜主纤维形态，该项目组随后引入了定向冷冻技术，在计算机辅助设计下，将石蜡容器中的明胶材料制作成具有一定角度的仿生牙周膜纤维，并与天然牙的牙根表面形态进行适配，通过体外细胞毒性和物理性能检测发现其在生物相容性和结构稳定性方面均具有优良表现。以上研究均表明现有的技术手段已能够制造出具有精细结构的牙周膜纤维仿生引导结构，使得利用材料的表面拓扑结构引导牙周膜纤维走形和排列方式的可行性得到进一步证实。
3.影响牙周膜再生的特异性因素
3.1牙周炎性环境的影响
炎性环境对牙周膜细胞，尤其是具有多向分化潜能的PDLSCs的影响是不可忽视的。大量文献报道，炎性环境中PDLSCs的增殖活性和分化潜能发生显著改变。有学者将牙周炎患者牙周炎性组织中分离出的PDLSCs（I-PDLSCs），以及牙龈卟啉单胞菌脂多糖（PgLPS）、白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的模拟炎性环境下培养的PDLSCs分别与健康人群牙周组织中的PDLSCs（HPDLSCs）相比，结果发现，炎症环境中细胞的增殖活性均明显提高。此外，I-PDLSCs在体外成骨诱导培养和体内小鼠实验中表现出明显降低的成骨-成牙骨质分化潜力。
也有研究表明，大肠杆菌脂多糖（EcLPS）通过激活ERK1/2信号分子而促进PDLSCs的成纤维、成脂及成软骨分化过程，并间接抑制其成骨分化潜能。然而，另有研究者用EcLPS或PgLPS刺激PDLSCs后发现，细胞的成骨分化能力未受到明显抑制，甚至有所增强。另一方面，炎性环境中PDLSCs对单核-巨噬细胞的免疫抑制性亦发生改变。Tang等研究表明，与H-PDLSCs相比，I-PDLSCs使外周血单核细胞（mono nuclear cells，MNCs）的凋亡率明显降低，而产生白介素2（IL-2）、TNF-α、γ-干扰素（IFN-γ）等炎症因子的水平显著增加，提示I-PDLSCs的免疫抑制能力下降。类似的结果在PgLPS诱导的炎性环境中也得到证实。
与之相反，EcLPS诱导后的PDLSCs使MNCs中单核-巨噬细胞集落形成能力降低，表明在该炎性环境中PDLSCs的免疫抑制能力有所增强。以上研究结果的差异在一定程度上表明，个别炎症因子模拟的体外炎性环境存在差异性和局限性，并且可能会导致PDLSCs产生不同的应答反应，而机体内复杂的局部环境以及在不同的炎症反应阶段所产生的多种炎症信号通路可能会对实际病理环境中的PDLSCs造成更为多变的影响，其中的机制仍需进一步探索。
3.2机械负荷的影响
PDLCs对机械刺激非常敏感，受其影响能产生与细胞外基质生成、炎症应答反应以及组织重塑相关的多种生物活性成分，并在细胞的排列和形态上产生改变。因此，机械刺激也是牙周膜细胞外基质重塑和自我更新的重要影响因素之一。2012年，Oortgiesen等用间断性的单边循环拉力模拟口腔机械外力以检测机械负荷对PDLCs的影响。经荧光显微镜观察发现，机械负荷显著提高了胶原凝胶中PDLCs的增殖活性，并使细胞以垂直于拉力的方向有序排列，与天然牙周膜的发育过程相似，表明动态机械外力影响牙周膜细胞的形态和极性。
2016年，Kim等用类似方法探究了机械负荷与PCL明胶电纺膜表面定向排列的拓扑结构的协同作用，同样得到了动态机械负荷增强拓扑结构表面细胞排列极性的结果。此外，机械负荷的加入使PDLCs成骨相关标志物表达下降，牙周膜纤维形成相关标志物（TGF-β1、骨膜蛋白和生腱蛋白C）表达则显著增加，表明机械外力对牙周韧带生成和牙周膜重塑具有促进作用。以上研究均提示，模拟口腔机械负荷可作为辅助因素来介导牙周膜纤维束的定向再生，在牙周膜再生中的应用前景良好。
4.小结
目前，牙周膜再生的相关研究主要以组织工程技术为基础，通过对细胞交流网络和细胞附着表面的修饰来引导天然牙周膜样结缔组织的产生。尽管如此，这些组织再生方法仍需大量的体外细胞实验和体内研究来筛查和证明，相信理想的牙周膜再生方法应用于临床指日可待。
