钛种植体表面改性对巨噬细胞极化影响的研究进展

2020-1-10 10:01  来源:口腔颌面外科杂志
作者:李庆帆 王佐林 阅读量:7847

    种植修复在临床上得到越来越广泛的应用,其可避免对余留牙齿的损伤,同时最大可能的恢复咀嚼功能,又能保证义齿的美观性,相较于传统义齿修复具有很多优点。种植体植入后不可避免地会引起机体的免疫炎症反应。其作为一种生物材料,以往的观点一直认为,种植体应该在匹配被替换组织力学性能的基础上尽可能减少引起宿主免疫反应。

    所以,现阶段,临床应用最广泛的是惰性金属钛种植体。但是,一个为期19年的回顾性研究表明,仍有约47%的早期种植体失败是由于种植后不良的炎症反应导致的。所以,惰性金属钛的应用并不能完全满足临床要求。需要对钛材料表面进行改性处理,使其具有调控机体免疫炎症反应的作用,促进炎症反应向有利于组织修复与再生的方向发展,保证种植体植入的成功及长期存留。

    种植体植入后可引起机体的固有免疫反应,巨噬细胞作为固有免疫系统的第一道防线,在此过程中发挥重要的作用。近二十年的研究认为,巨噬细胞不仅具有吞噬及消化的作用,还可通过分泌趋化因子和细胞因子,在组织修复与改建中发挥重要作用。

    巨噬细胞迁移至损伤部位后被激活,表现出与功能相关的两种极化状态:M1型与M2型,分别具有促进炎症反应及抗炎、促进组织修复的作用。相关研究表明,种植体的表面物理化学特性和形貌结构会影响巨噬细胞的分化及功能。所以,理解种植体植入后巨噬细胞生物学行为的改变及种植体表面改性对巨噬细胞极化的影响至关重要。本文就种植体表面改性与巨噬细胞极化相关的研究做一综述,以期为种植体表面设计与提升种植体的临床应用效果提供新的思路。

    1.种植体植入后的免疫反应

    种植体植入后机体的免疫反应是复杂的。首先是形成创面,极短时间内,体液中的蛋白质迅速吸附在种植体表面;随后,炎症细胞浸润,固有免疫系统的细胞是最先做出反应的细胞,其中单核细胞迁移至损伤部位后分化为巨噬细胞,之后形成富含生长因子、细胞因子及趋化因子的血凝块,吸引间充质干细胞、成纤维细胞迁移至损伤部位,启动组织愈合及骨再生的程序。

    可见,除了间充质干细胞、成骨细胞等骨形成细胞参与骨结合之外,炎症反应也是组织愈合过程中的必经步骤,其发生、发展和转归对骨结合的形成至关重要。例如,一项针对骨科植入物失败的临床研究表明,纯钛人工关节周围过量的M1型巨噬细胞分化是植入材料失败的重要相关因素,可导致周围骨吸收和植入物的松动。生物材料如今已被广泛的运用于医学领域中。

    关于生物材料与免疫炎症反应的关系也逐步得到深刻的认识和理解。早在1988年,Anderson等最早论述了机体对生物材料的免疫炎症反应,认为其最终结果是异物反应、肉芽组织形成和纤维包绕,对生物材料的成功和功能不利。相应地,当时认为理想的生物材料所具备的特征是生物惰性,尽量不激惹免疫炎症反应。

    随着生物材料的发展与免疫炎症反应研究的深入,目前对炎症反应在生物材料愈合与组织再生中的作用有了全新的认识:宿主的免疫炎症反应不仅是不可避免的,而且是促进组织愈合、再生所必须的。所以,为了促进骨愈合,提高种植体的成功率及骨结合的效率,植入材料的免疫调节作用应当在种植体设计时作为考虑因素。

    2.巨噬细胞在种植体植入后的免疫反应中的作用

    巨噬细胞广泛分布于组织中,是执行固有免疫的效应细胞。巨噬细胞起源于骨髓的单核母细胞,进入血液后形成单核细胞,当发生损伤时,迁移至损伤部位分化为成熟的巨噬细胞。以往的观点认为,单核细胞是巨噬细胞的唯一来源,但现在越来越多的证据表明,许多组织固有的巨噬细胞起源于胚胎发育时期。

    作为机体内重要的吞噬和抗原提呈细胞,巨噬细胞在早期免疫过程中发挥重要作用。此外,巨噬细胞在调节宿主对植入物的反应中也发挥关键作用。随着非特异性蛋白吸附在种植体表面,单核细胞黏附并分化为巨噬细胞,活化的巨噬细胞分泌细胞因子,诱导淋巴细胞及其他类型的细胞参与免疫反应,从而调节炎症反应,启动植入物部位的损伤修复及改建。如果炎症在2~4周内未被消除,巨噬细胞发生融合,形成大的多核的异物巨细胞(foreign body giant cells,FBGCs),并形成纤维瘢痕组织。

    异物巨细胞释放氧自由基、降解酶及酸,最终导致种植体失败。巨噬细胞有很强的可塑性,可以针对外界微环境的信号分化为具有不同表型和功能的亚型,此过程称为巨噬细胞极化。极化的巨噬细胞可以分为:经典活化的M1型巨噬细胞和选择性活化的M2型巨噬细胞两种类型。

    M2型巨噬细胞又可进一步分为3个亚型:M2a、M2b和M2c型。M1型巨噬细胞多由γ-干扰素(IFN-γ)或脂多糖(LPS)诱导分化,分泌IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、TNF-α等促进炎症的因子,引起机体的免疫炎症反应。M2型巨噬细胞多由IL-4或IL-13诱导分化,主要分泌IL-4、IL-10、TGF-β等抗炎因子及CCL-13、CCL-18、CCL-22等趋化因子,具有抗炎及促进组织修复的作用。

    M2型巨噬细胞也会分泌一些生长因子,包括血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β(TGF-β),促进间充质干细胞的迁移、归巢和成骨分化。同时,M1、M2型巨噬细胞在不同的刺激下又可相互转化。即:M1型巨噬细胞在IL-4或IL-13刺激下可转化为M2型,而M2型巨噬细胞在脂多糖、γ干扰素刺激下又可转化为M1型。材料植入后,早期黏附的巨噬细胞多呈M1型分化,释放多种促炎因子。随后巨噬细胞向M2型分化,抑制炎症发展,促进干细胞分化及组织修复、再生。所以,种植体周围巨噬细胞的M2向分化程度决定了炎症及组织再生修复的进展。

    3.种植体表面改性调节巨噬细胞生物学行为

    Thalji在一项系统评价中指出,在骨-生物材料整合领域的所有研究中,超过90%的研究集中在生物材料对间充质干细胞/成骨细胞生物学行为的影响,仅有不到10%的研究专注于生物材料的骨免疫反应。鉴于免疫炎症反应的发展和结果将影响植入材料的成功与维持,所以理想的生物植入材料应具备免疫调节的作用,尤其是对巨噬细胞的生物学影响。

    目前,生物材料调节巨噬细胞,发挥免疫调节作用的方式主要有2种:一是改变种植体表面的物理化学特性,二是联合生物活性物质,调节种植体与宿主的反应。第一种方式,包括提高种植体的耐磨性能,调节表面润湿性、电荷、粗糙度、表面化学或改变表面形貌。第二种方式主要通过构建生物活性材料表面,使材料表面功能化或添加聚合物涂层,释放可溶的小分子物质或生物活性因子以达到调节免疫反应的作用。首先,种植体材料表面不同的物理特性可影响巨噬细胞的黏附、形态、迁移、炎性因子的分泌等,也可影响巨噬细胞的极化。

    早在2004年就有研究者对不同粗糙度钛表面对巨噬细胞的影响进行了实验研究,设置了4个实验组,分别为光滑表面、粗糙表面(包括3种:喷砂形成的粗糙表面、酸蚀形成的粗糙表面、喷砂酸蚀形成的粗糙表面即SLA表面),发现无论有无LPS刺激,粗糙表面更容易诱导巨噬细胞分泌炎症因子(如IL-1α、IL-6和TNF-α,P<0.05)。同时,表面形貌也会影响趋化因子的分泌,在LPS刺激下,SLA表面巨噬细胞分泌更多的趋化因子(P<0.05),无LPS刺激时,巨噬细胞在SLA表面分泌趋化因子较少。此体外实验表明,种植体表面形貌可以调节巨噬细胞炎症因子及趋化因子的分泌。为了进一步验证粗糙度对巨噬细胞的影响,Tan将J744A.1巨噬细胞分别接种在光滑钛表面及大颗粒喷砂酸蚀的钛表面,经过24~72h,发现无LPS刺激时,喷砂酸蚀表面巨噬细胞相比光滑表面表达更多IL-1β,IL-6表达较少。

    当细胞受到LPS刺激时,2种形貌培养的细胞都高表达IL-1β和IL-6。以上研究表明,材料表面粗糙度是影响巨噬细胞功能的重要因素,在无外界刺激时,粗糙表面的巨噬细胞分泌更多的炎性因子。Luu等通过蚀刻技术,在钛表面制备微米级及纳米级宽度的凹槽(150nm~50μm),将小鼠巨噬细胞接种在这些带有凹槽的钛表面进行培养。发现这些沟槽有助于巨噬细胞的伸长,在400~500nm宽度的凹槽中,巨噬细胞的伸长达到顶峰,且抗炎细胞因子IL-10分泌量最高。这些研究结果表明,种植体表面形貌特征可通过调节巨噬细胞形态,进而调节巨噬细胞的功能。

    研究者Ma等将纯钛材料分别在5、20V的电压下进行阳极氧化,制备形成了具有不同管径纳米管的TiO2表面,体外实验观察巨噬细胞的反应,发现具有小管径纳米管的钛表面可促进巨噬细胞向M2型即抑炎型极化,而具有大管径纳米管的钛表面促进巨噬细胞向M1型即促炎型极化,进而影响种植体周围组织愈合及骨组织再生,提示巨噬细胞在骨愈合的炎症反应中发挥重要作用,且可以通过改变种植体表面形貌调节巨噬细胞极化来调控免疫反应。

    据估计,骨的表面粗糙度约32nm,这使得纳米材料在骨组织工程领域具有潜在的应用前景。探明种植体表面的理化因素对巨噬细胞黏附及极化的影响对于研制新型种植体具有重要作用。目前,对于改变材料表面物理特性影响巨噬细胞生物学行为的机制研究甚少,且当前的研究还主要集中在平面材料对细胞的作用,三维结构等特殊形貌对巨噬细胞的功能及在组织修复再生中的作用还未进行研究。

    同时,人类组织来源的巨噬细胞是否存在此种关系还有待进一步验证。其次,材料表面化学改性也是调节巨噬细胞的重要方式。免疫细胞与种植体作用是通过种植体表面特异性蛋白受体连接位点。经化学方式处理的种植体表面,蛋白质结合位点也会发生改变,进而影响免疫细胞的反应。

    有研究证实,通过化学方法使种植体表面呈疏水型、亲水型或离子型改变后,巨噬细胞的生物学行为会产生相应的变化。在亲水型、阴离子表面培养巨噬细胞,细胞IL-10的表达明显高于疏水性、阳离子表面,相反IL-8的表达量在亲水性、阴离子表面降低。进一步的分析表明,亲水性及阴离子表面可以抑制单核细胞黏附及巨噬细胞融合形成异物巨细胞的过程。

    为了检测表面化学特性对巨噬细胞极化及细胞因子分泌的影响,将巨噬细胞分别培养在几种不同的表面。发现光滑钛表面可诱导炎症性M1型巨噬细胞活化,促进IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌,相反亲水的粗糙钛表面可诱导M2型巨噬细胞活化,IL-4和IL-10分泌升高。这些研究结果表明,巨噬细胞培养在具有高表面润湿性的钛表面上,可诱导产生抗炎的环境,提高种植体的成功率。第三,将种植体表面与不同功能的涂层相结合,调节巨噬细胞极化也是较为常见的方式之一。

    Li等通过等离子喷涂技术将二氧化铈与羟磷灰石涂层结合,在其上培养小鼠RAW264.7巨噬细胞。结果发现,此种涂层在促进骨髓间充质干细胞成骨分化的同时可以诱导巨噬细胞向M2型极化,主要表现为M2型巨噬细胞标志物CD163和CD206表达上调,抗炎细胞因子(IL-10和IL-1ra)升高,M1型巨噬细胞表面标志物(CCR7和CD11c)和促炎细胞因子(TNF-α和IL-6)下调,活性氧的产生减少,有效促进二氧化铈改性的涂层上巨噬细胞向M2型分化的趋势。

    最后,种植体表面的生物改性也是目前研究的热点问题。通过负载生物分子,控制生物活性因子的释放,实现调节巨噬细胞极化的作用,抑制炎症进展,促进组织愈合。IL-10作为一种重要的抗炎因子被广泛应用。Carvalho等将IL-10结合在葡聚糖的纳米凝胶中,发现可以通过细胞因子的缓慢释放,实现抗炎的作用。然而,IL-10在动物模型中可以发挥作用,但在人体临床试验中却未获得有效的结果。

    Hachim等通过层层自组装的方法在种植体表面加载纳米厚度的壳聚糖及硫酸皮肤素的混合涂层,此涂层负载并可缓释IL-4(一种可以诱导巨噬细胞向M2方向极化的因子),在体外可以促进M2型巨噬细胞的分化,减少M1型巨噬细胞的分化,同时小鼠体内实验也证明在组织与种植体的接触界面,M2型巨噬细胞的比例增加,M1型巨噬细胞的比例减少,从而减轻种植体周围纤维囊的形成,促进组织的愈合。设计能够序列释放多种化学因子或生物分子的支架材料,通过调节巨噬细胞极化促进血管再生也有很大的前景。

    Kumar等制备了能够序列释放多种细胞因子的仿生多肽水凝胶,通过释放单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和IL-4,分别活化单核细胞及巨噬细胞。Spiller通过修饰去细胞骨支架,使其在早期促进巨噬细胞M1型分化,分化的M1型巨噬细胞分泌血管内皮生长因子VEGF,激活血管再生,然后持续释放IL-4,促进巨噬细胞M2型分化,其分泌血小板来源的生长因子(PDGF-BB)促进后期的血管成熟。

    IFN-γ及IL-4是分别通过物理吸附及生物素链霉素结合的方式负载在支架材料,实现了IFN-γ的早期释放,IL-4的持续释放。此种去细胞的骨支架有效地引发了从M1巨噬细胞到M2巨噬细胞的序列分化。大鼠皮下植入模型也证实了序列释放IFN-γ及IL-4的骨支架可以有效调节炎症反应,同时促进血管再生。种植体表面生物改性除了负载细胞因子,负载抗体、抗炎多肽也是常用的方法。

    例如,广泛应用的多肽促黑激素(α-MSH),具有抗炎的作用,研究者成功地将α-MSH结合到材料表面,并植入体内,观察到活化的巨噬细胞数量减少,TNF-α分泌也有所减少,从而缓解了炎症反应。除此之外,小干扰RNA(siRNA),miRNA也可被用来调节免疫反应,促进组织愈合,尤其是通过调节巨噬细胞的功能,提高其在组织再生中的应用。

    4.巨噬细胞与间充质干细胞的相互作用

    间充质干细胞可以分泌抗炎因子IL-10、VEGF,本身也具有免疫调节作用。Chen等的研究表明,骨髓来源的间充质干细胞条件培养基可以促进巨噬细胞及内皮细胞迁移至损伤部位参与组织修复。BMSCs也可释放巨噬细胞炎性蛋白(MIP)和单核细胞趋化蛋白(MCP),促进单核、巨噬细胞的归巢。同时,体外培养的间充质干细胞可以诱导M2型巨噬细胞标志物表达(如CD206,CD163,CD16)及分泌相关因子(IL-10和VEGF),并抑制M1型巨噬细胞标志物的表达(IFN-γ)。

    反过来,巨噬细胞又会刺激间充质干细胞产生诱导其向M2型分化的因子(如IL-4和IL-13)。M2型巨噬细胞及其分泌的因子(IL-10、TGF-β1、TGF-β和VEGF)促进MSCs生长,而M1巨噬细胞及其相关的因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ)抑制MSCs生长。

    5.总结与展望

    综上所述,种植体骨结合是一个由炎症反应引发的复杂生物学过程。种植体的表面特性不仅可以直接影响骨形成细胞,如破骨细胞、成骨细胞,调节骨代谢,也可以间接作用于骨免疫系统,调节巨噬细胞、T淋巴细胞等分泌相应细胞因子参与组织的修复与再生。且两种作用形式是相互交叉影响的,从这点上也说明了骨免疫系统和骨组织代谢的偶联关系,也肯定了骨免疫学在骨代谢研究中的重要性。

    巨噬细胞作为固有免疫的重要组成部分,同时又是种植体植入机体后最先做出反应的细胞,其可塑性使其在组织修复与再生中发挥重要的作用。所以,研究巨噬细胞在机体免疫炎症反应中的作用以及种植体的不同特性对巨噬细胞的生物学行为的影响,具有极为重大的理论意义与临床价值。在进行种植体设计时,要充分考虑骨免疫系统的作用,平衡炎症与抗炎之间的关系,才能保证种植体获得良好的效果。随着种植体表面改性与免疫调节的作用逐渐引起重视,今后的发展趋势是在钛种植体表面构建具有低免疫原性及免疫调节功能的生物活性涂层,研发具有免疫调节能力的新型种植体,促进骨形成,实现早期和长期稳定的骨结合,提高种植体成功率及长期存留率。

编辑: 陆美凤

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