龈沟液生物标志物在慢性牙周炎诊疗中的研究进展

2020-6-24 09:06  来源:口腔医学
作者:陈崇崇 钟良军 阅读量:6004

    慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)是由口腔微生物感染引起的牙周组织的慢性炎症性疾病,表现为牙龈炎症、进行性附着丧失及牙槽骨吸收,是导致牙齿松动、缺失的主要原因。CP是多因素疾病,由多个与环境和宿主相关的危险因素决定,包括菌斑生物膜、遗传因素、全身系统性疾病和不良的宿主行为如不良口腔卫生习惯、吸烟等。

    龈沟液(gingival crevicular fluid,GCF)是一种生理性液体,也是一种炎性渗出物,来源于龈沟或牙周袋的牙龈上皮衬里下方血管丛。GCF的液体成分主要来源于血清,其成分为免疫球蛋白、补体蛋白炎症介质等,还含有脱落的上皮细胞、细菌等微生物。牙周炎始发于牙龈组织,其始动因子为菌斑生物膜。其病理特征是毛细血管通透性增加,扩张充血,炎症细胞从外周血渗出至GCF中,炎症细胞释放出胶原酶,致使胶原纤维开始被破坏。组织降解最初仅限于结缔组织的上皮细胞和胶原纤维,炎症继而迁延至深层牙周支持组织,导致牙槽骨吸收,从而发展至牙周炎。

    非手术治疗是目前治疗CP的最主要手段之一,龈下清创术(与菌斑控制相结合)是减少探诊深度(probing depth,PD)和改善附着水平的有效治疗方法,适用于各种类型的牙周炎患者。在菌斑控制良好的基础上,即使有深牙周袋,通过非手术治疗也能取得很好的治疗效果,而不一定需要进行手术治疗。

    1.龈沟液和牙龈炎症状态的关系

    GCF增多是牙龈炎症典型的临床表现之一。GCF增加归因于血管渗透性增加和壁袋的炎症介质增加,GCF的组成随炎症状态而改变,因此,通常被认为是潜在组织变化的可靠指标。比较来自患牙周病个体的健康部位与来自牙周健康个体的健康部位时,GCF的组成在微生物组成、生物标志物的浓度和组成方面均不同,并且在疾病进展期,GCF组成也有明显变化。邱大鹏等发现重度牙周炎位点的GCF量多于轻度牙周炎位点,疾病位点的GCF量高于健康对照者的位点。另外,在维护期中,不良的口腔卫生即局部的炎症状态会引起GCF量的再次增加。

    2.理想的牙周疾病诊断方法

    常用的传统牙周诊断程序的优点是操作简便、成本效益高且相对无创,但局限在于检查敏感性较低,无法实时、精准把握牙周组织的炎症状态和炎症变化。CP的病损初期即有GCF生物标志物的改变,PD和附着丧失的变化直到病损确立期和晚期才会发生改变,牙槽骨在吸收2~3mm才能够在X线检查中观察到。当比较来自患病个体的健康部位与来自牙周健康个体的健康部位时,GCF在微生物组成和生物学标志物的浓度和组成方面不同,且在疾病进展期间GCF组成也发生明显变化。

    牙周疾病诊断研究正朝着通过生物标志物等客观测量的方法来识别和量化牙周风险的方向发展,因其敏感性高、无创,可高效且准确评估和预测牙周状态。唾液的收集技术要求虽较GCF简单,但是由于蛋白质丰度大、组成复杂等,利用唾液作为检测来源更具挑战性。GCF作为局部的炎症渗出物,相较于唾液具有明显的牙位、位点特异性。GCF检测方式虽有上述优势,但也有其局限性。

    首先,GCF流出量极易受牙龈上皮溃疡程度及炎症状态影响,当牙龈有炎症时易出血,会干扰GCF的收集和后续检测;其次,GCF存储和分析方法存在较大差异,使得检测个体细胞因子和趋化因子表达水平差异大;最后,样品存储方式也值得深入探究。因此,寻求理想的牙周疾病诊断方式仍需进一步探索。

    3.慢性牙周炎患者非手术治疗前后龈沟液生物学标志物的改变

    3.1与炎症有关的生物标志物

    3.1.1Azurocidin

    Azurocidin是一种中性粒细胞来源的蛋白质,与脂多糖结合破坏革兰氏阴性细菌外膜的结构。Azurocidin能激活内皮细胞,导致血管渗漏和水肿形成。Azurocidin对牙周炎的早期诊断、疾病分期及进展、对治疗反应均有指示作用。Guzman等发现Azurocidin在基线时上调并随着治疗过程的进行而下调至消失。Choi等发现Azurocidin可能对破骨细胞分化具有抑制作用,在牙龈炎患者中发现Azurocidin水平升高,可能是在早期阶段对牙槽骨具有保护作用。但在重度牙周炎患者中,Azurocidin水平降低,可能其失去保护作用,晚期牙槽骨吸收加重。因此,Azurocidin可能作为牙周炎早期诊断及疾病发展重要的生物标志物。

    3.1.2褪黑素(melatonin,MT)

    MT是一种吲哚胺激素,可在松果体、骨髓、淋巴细胞等合成,其受体在多数外周组织器官如口腔黏膜有表达。MT在牙周细菌及其代谢产物刺激下,局部被诱导合成进而抗炎、抗氧化及促进骨生成等,从而防止牙周组织氧化损害和促进损伤组织的修复或重建。炎症作为触发信号来诱导局部MT水平的表达上调,以发挥其保护作用。牙祖科等发现牙周炎患者GCF中MT、IL-1β水平均高于治疗后,表明治疗前后牙周炎症状态改善;且MT水平在治疗前与PD和探诊出血(bleeding on probing,BOP)均呈正相关,说明炎症越重MT的表达水平越高。MT可用于疾病诊断及反映非手术治疗前后效果。

    3.1.3骨膜素(Periostin)

    Periostin是一种在骨膜、牙周膜中高度表达的基质细胞蛋白,它在胶原纤维形成中起作用,对组织完整性和成熟至关重要。与非牙周炎患者相比,侵袭性牙周炎(Aggressive periodontitis,AgP)和CP患者的GCF骨膜素水平显著降低。

    Balli分析了健康组,牙龈炎组和CP组的GCF和血清中Periostin水平,得出类似的结论即GCF中Periostin浓度随着牙周病的严重程度增加而降低。Periostin作为一种可靠的炎症生物标志物具有前景,可用于诊断和鉴别诊断。

    3.1.4各类细胞因子和趋化因子

    各种细胞因子和趋化因子在牙周病的发病机制中起重要作用。牙周病致病菌抗原作用于牙周组织单核-巨噬细胞,分泌多种细胞因子,与牙槽骨破坏吸收有着密切关系。白介素-1(interleukin-1,IL-1)参与免疫调节、介导炎症反应和影响组织代谢,刺激骨髓多能干细胞增殖,诱导其他多种细胞因子分泌如IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)等。

    Thunell等发现与健康部位相比IL-1α和IL-1β在炎症部位显著升高,经过非手术治疗后显著减少。Gonzales等模拟实验性龈炎也得到上述结果。但Eshghipour等表示实际的证据不足以证明接受牙周治疗的患者可降低GCF趋化因子/细胞因子。有研究发现非手术治疗后GCF和血清中TNF-α水平、sTNFR2/R1比率未有明显差异。

    3.2与软组织破坏有关的生物标志物

    3.2.1基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)

    牙周组织的降解主要由炎症过程中释放的酶诱导,特别是MMP家族。MMP-8作为生物标志物中重要的观测指标之一,可用于预测、诊断和确定牙周炎和种植体周围炎的进展期,以及用于监测非手术治疗和药物治疗效果。Mantyla等提出了MMP-8椅旁快速免疫检测试验以诊断和监测牙周炎的病程和治疗。deMorais等对6篇有关MMP-8在牙周病患者GCF和唾液中表达的科学文献进行评估,发现随着牙周病程度加重,MMP-8浓度显著增加。

    有研究发现在非手术治疗后6个月,MMP-8水平从(61.30±63.43)ng/mL降至(30.32±29.77)ng/mL。MMP-3和MMP-9在生理和病理条件下对结缔组织破坏的起始具有重要的作用,与健康部位相比,牙周受累部位的GCF中水平增加,经牙周治疗后水平明显下降。因此,MMPs可用于鉴别诊断牙周病进展期及评估疗效,但在临床中未广泛使用。

    3.2.2细胞粘附分子(cellular adhesion-molecule,CAMs)

    CAMs是参与细胞间结合,内皮细胞或细胞外基质结合的细胞表面蛋白。Hannigan等从牙周健康,牙龈炎和牙周炎部位收集GCF,分析sCAMs,sICAM-1,sVCAM-1和sE-Selectin,同时研究非手术治疗对患病组的每个部位中sCAM水平的影响。结果表明治疗后sICAM-1水平显著下降。sCAM水平的变化可能是区分健康部位和牙周炎的敏感指标。

    3.3与骨组织破坏有关的生物标志物

    3.3.1RANKL/OPG

    骨吸收的调节剂-核因子κB受体活化因子配体(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL)和OPG(osteoprotegerin,OPG)是GCF诊断标志物的潜力分子。OPG为肿瘤坏死因子受体超家族成员,是一种可溶性糖蛋白。RANKL则是肿瘤坏死因子配体超家族成员,是成骨细胞分泌的膜蛋白,它能与核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)结合,通过一系列酶促级联反应引起破骨细胞的活化。由于OPG能竞争性地与RANKL结合,阻断RANK与RANKL间的相互作用,从而抑制破骨细胞的形成和活化,OPG/RANKL/RANK成为破骨细胞活化的分子基础,OPG/RANKL比例的变化影响着破骨细胞的形成和活化。

    RANKL和OPG都可以在GCF中检测到,与健康或牙龈炎相比,在牙周炎中RANKL增加而OPG减少,RANKL/OPG比值增加。但在经过非手术治疗后RANKL/OPG比率并没有降低。该比率可作为未治疗牙周炎的生物标志物,或者表明该部位疾病的既往病史,但它不能评估治疗效果。RANKL/OPG比率上升,表示骨吸收的分子机制仍在活跃,在相应的牙位仍然存在复发的潜在风险。

    3.3.2I型胶原羧基肽(ICTP)

    ICTP是吡啶啉交联家族的成员,由胰蛋白酶或细菌的胶原酶降解骨I型胶原产生,可不受炎症反应干扰,是骨吸收的特异性标志物。GCF中ICTP的含量可反映牙周炎患者牙槽骨的破坏程度,与牙周健康或牙龈炎相比,牙周炎患者的GCF中ICTP显著升高,且显示与牙周临床参数密切相关。有研究发现非手术治疗后ICTP水平降低。因此,ICTP有望成为牙周炎诊断及疗效评估的辅助指标。

    3.4其他龈沟液生物标志物

    3.4.1天冬氨酸转氨酶(AST)

    AST是GCF中从坏死细胞释放的组织破坏生物标记物,与牙周炎的严重程度有关,研究发现AST水平与临床参数如PD,CAL,BOP等呈正相关。AST阳性位点与牙龈卟啉单胞菌,中间链球菌,消化链球菌等的检出率正相关。为了评估AST与牙周病之间的关系,Oringer对牙周炎受试者进行12个月追踪调查发现在非手术治疗后,与基线相比,在6个月和12个月时AST水平和BOP位点百分比显著降低。

    3.4.2谷胱甘肽(glutathione,GSH)

    GSH是GCF中重要的氧化还原调节剂,有研究指出牙周炎的发生可能是由于宿主对病原微生物及其产物的过度反应导致GCF中活性氧与抗氧化剂之间的不平衡,因此维持稳定的还原型GSH与氧化型GSH的比例对牙周健康至关重要。经完善非手术治疗后牙周炎患者血清和GCF中还原型GSH浓度降低,恢复了氧化还原平衡。GSH辅助治疗牙周炎,恢复与氧化应激相关的组织损伤和促进伤口愈合的效果不容小觑。

    4.蛋白组学时代的龈沟液

    蛋白组学工具彻底改变了人类疾病早期蛋白质和多肽的表征变化的检测。蛋白质组学科学利用聚丙烯酰胺凝胶电泳,高压液相色谱,质谱(mass spectrum,MS),基质辅助激光解吸电离和表面增强激光解吸/电离质谱等工具用于帮助生物医学及临床医学不同领域的研究。

    近年来,对唾液和腮腺主要分泌物进行蛋白质组学分析主要得益于MS进展迅速,有助于非侵入性口腔和全身诊断性生物标记的开发。这些研究的对象是无牙周疾病或系统性疾病个体的全唾液或腮腺分泌物,建立健康的蛋白质组基线,并与疾病状态下蛋白质组成进行比较,筛选发现特异性较高的生物标志物。GCF由于其样本量非常小,通过经典生物化学方法鉴定难度较大。

    MS具有高灵敏度,使GCF的蛋白质组分得以大规模鉴定及分析,可以更加全面地描述健康或者疾病状态的GCF。目前,GCF定量蛋白质组分析仍处于起步阶段,Bostanci等使用LC/MS进行定量蛋白质组学分析,发现在健康对照样品中检测到胱抑素B和防御素,在AgP患者GCF中检测到L-塑性蛋白,其作为牙周病标志物的价值仍有待进一步研究。非靶向的高通量蛋白组学用于鉴定诊断牙周病生物学标志物方面具有很大的潜力,这种新技术的运用扩大了鉴定的蛋白质数量,极大地补充了迄今为止收集的关于牙周健康和疾病中蛋白质特征的信息。

    目前研究中最常检测到的蛋白质是肌动蛋白、角蛋白、组蛋白、蛋白质S100-A9等,由于牙周炎的复杂性,涉及大量炎症因子,可以通过寻找能够指示早期病损的生物标志物,用于鉴别诊断、分析疾病进展和治疗反应,并指示明确的临床结果。蛋白组学研究发现非手术治疗后Azurocidin,溶菌酶C,肌球蛋白9和平滑肌肌动蛋白是敏感度较高的生物标志物,可用于确定牙周病的终点。

    目前虽然已有对GCF进行基于MS的蛋白质组研究,但这些研究主要处于“定性水平”,对GCF的“定量分析”较少,归因于GCF样本采集量较小,从收集条或玻璃中有效洗脱总蛋白质难以准确定量。为克服现有限制,有学者使用LC-ESI-MS/MS技术结合“金标准”稳定同位素标记化学方法从健康与牙周炎患者中定量GCF蛋白质组,对蛋白质数量进行了最大限度的鉴定和量化,这一技术创新不断推进GCF在牙周病诊断鉴定中的地位。

    5.展望

    目前,已发现许多GCF生物标记物可作为牙槽骨吸收和牙周炎发病的潜在指标,但这些标记物与牙周炎的进展和牙周治疗预后相关性的证据尚不充分。根据研究结果综述,IL-1β是最常见的细胞因子,而MMP-8是牙周炎患者GCF中最丰富的胶原酶。RANKL是提示破骨活性的关键生物标志物,是牙周炎的重要诊断指标。综上,这些研究尚不能证明某种单一的生物标志物比其他标志物具有更好的预测性,通常建议采用牙周临床评估结合多种GCF生物标志物的检测进行牙周病的诊断。随着定量蛋白质组学技术的发展和GCF蛋白组学研究的进展,牙周病GCF生物标志物谱的鉴定在辅助牙周临床检查和诊断中的应用具有很大的前景,为牙周疾病的个性化预防、诊断和治疗管理提供依据。

编辑: 陆美凤

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