人类口腔中存在着多种多样的微生物，它们在抵抗口腔中液体流动和咀嚼的机械剪切力的同时，进化出定植在口腔的独特功能，并且可以信息传递。2007年，人类微生物组计划（HMP）在口腔和咽部采集了唾液、口腔黏膜（面颊）、角化牙龈（牙龈）、腭、扁桃体、喉、舌软组织、龈上和龈下牙菌斑共9个位点标本进行16SrDNA测序，提示了微生物菌落与功能之间的关系，以及人体微生物组变化可能与疾病健康存在联系。但是，18岁以下的儿童被排除在这项研究计划之外。一项最新的研究对来自口腔和肠道2个人体壁龛的基因组进行了交叉研究荟萃分析，覆盖了13项研究中的3655个样本，在数据集中发现了惊人的遗传异质性，在95%的一致性水平上共鉴定了45666334个非冗余基因（23961508个口腔基因和22254436个肠道基因）。
据统计，已测序的口腔细菌占所有身体部位的26%，这些在口腔内表面生长的微生物因位置不同而各异，每个部位都包含了50～1000个种类的子集。随着测序成本的持续降低、生物信息分析工具的发展以及功能研究知识的积累，近年来在人体共生微生物领域，尤其是疾病关联研究取得了诸多突破性进展。Zhang等首次结合口腔微生物与肠道微生物开展类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）相关研究，发现唾液乳杆菌在RA患者的牙菌斑、唾液和粪便中均显著富集，嗜血杆菌在RA患者中呈现相对缺失的状态；口腔与肠道菌群宏基因组学有助于区分不同病程，帮助判断甲氨蝶呤、雷公藤多甙等药物疗效，有利于对RA患者进行疾病分层和药物疗效预警。
研究证实，许多疾病都与口腔菌群失调有关联，但是研究多集中在成人群体，而关于儿童口腔微生物组与疾病关联的研究鲜有报道，但这并不意味着儿童口腔微生物组与疾病的关联程度不高。儿童龋齿就是与口腔微生物组紧密相关的疾病之一。儿童龋齿是最为常见而又易被忽视的口腔疾病。在我国，儿童龋齿患者越来越多，而对其重视程度远远迟于成人，导致龋齿的治疗不及时，个别严重情况甚至影响儿童发育。本文旨在系统阐述儿童口腔微生物组随着生长发育呈现的菌群结构变化，龋齿人群相较健康人群的口腔微生物群落变化，与龋齿相互关联的菌群标志物，以及菌群标志物作为防治龋齿的有效方法的可能性。
1.儿童生长发育阶段的口腔菌群变化
1.1样品采集
婴儿期的口腔样品只能收集唾液，采集前2h不能进食。对于2岁以内的婴幼儿，通常采用手压泵（hand pump）收集非刺激性的唾液样品至离心管；而对于儿童，可收集口香糖或石蜡片刺激下的唾液。无论以哪一种方式收集，样品需及时放入无菌管，置于-80℃。除唾液外，已经发育出乳牙的儿童可收集牙菌斑样品，针对患有龋齿的儿童，可采集龋齿表面牙菌斑用于后续研究。虽然唾液样本很好地代表了口腔微生物的总体多样性，但可能与牙齿生物膜上的细菌组成不完全相关，而牙齿生物膜上的细菌群落组成是疾病发生或发展的更主要原因。
1.2口腔菌群时序变化和梯度变化
Dzidic等通过收集90名儿童3、6、12和24月龄以及7岁的唾液样品进行16S（V1～V5可变区）分析，结果发现：（1）唾液样品中的“早期定植者”包括链球菌属、韦荣球菌属和乳酸杆菌，例如链球菌属在哺乳期婴幼儿12月龄时丰度增高，但随年龄继续增长有所降低；（2）兼性双球菌（属）、罗思氏菌属、颗粒链菌属和嗜血杆菌属是口腔内“持续定植者”菌群，在3月龄与6月龄样品中开始出现，并随年龄增长增加；（3）放线菌、卟啉单胞菌属、营养缺陷菌属与奈瑟氏菌属是“后期定植者”，在12月龄样品中占主导；（4）2岁内服用过抗生素的儿童中，梭杆菌属、韦荣球菌属和乳酸杆菌在2岁和7岁时有增加；相反，奈瑟菌属、链球菌属在未服用过抗生素的7岁儿童中水平较高。除了时序的不同，口腔微生物的空间分布也在健康和疾病中也发挥了一定的作用。
Proctor等对31名成年受试者，采集口腔内不同牙齿位置如牙齿的颊面、舌面或口腔黏膜的标本进行16SrDNA测序，结果发现：（1）健康人的磨牙和切牙的细菌群落能够区别开来，磨牙殊异韦荣菌、副流感嗜血杆菌富集，切牙硬棒状杆菌、龋齿罗氏菌富集；（2）口腔内的微生物群落结构形成了“前后梯度”，靠牙齿舌侧的细菌群落的梯度比靠颊侧的要明显；（3）唾液流量影响微生物群落的空间组织和生物分布模式；而微生物群落的时间与空间模式对健康和疾病状态的形成可能发挥作用。目前针对儿童尚无明确的口腔菌群空间分布的报道。
1.3口腔菌群的影响因素
分娩方式被视为影响新生儿口腔菌群的一个重要因素，在这方面，包括肠道、阴道、皮肤以及母乳和早期食物在内的不同母体微生物来源的组合，可能会形成早期口腔微生物群。Li等在婴儿出生后立即收集了样本，并比较了不同分娩方式婴儿的口腔微生物群在定植模式上的差异。目的是探讨影响婴幼儿口腔微生物结构的可能因素，并提示常用的妇产科消毒方法可能对顺产婴儿的口腔菌群产生影响。新生婴儿口腔中共有6种不同的菌群，分别为放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、互养菌门、软壁菌门。
在阴道分娩组中，相对丰度高的是厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门；在剖宫产组中，拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门丰度较高。其他因素如母乳喂养时间、使用抗生素也具有长期影响。母乳喂养的婴儿在12月龄时韦荣氏球菌属有所增加，原因可能是高水平的乳糖发酵起到一定的富集作用。研究证明，在2岁内服用过抗生素的婴幼儿中，梭杆菌属、韦荣球菌属、乳酸杆菌的含量上升，未服用抗生素的婴幼儿奈瑟菌属、链球菌属有所上升。相比之下，成人的口腔微生物组成似乎对抗生素治疗显示出一定的适应能力。
2.龋齿相关的生物标志物
前面提到随着年龄的增长微生物群落会发生变化，在儿童成长发育的某些阶段，由于特定的生理、饮食和环境暴露，微生物群落的多样性和组成会发生重大变化，这些因素都为寻找细菌标志物带来很大挑战。目前评估龋齿风险可通过菌斑变形链球菌计数和唾液中乳酸杆菌计数，结合特异性个体的身体状况与生活背景来完成。
Teng等采集了20名健康儿童与20例龋齿患儿的牙菌斑和唾液样品进行16SrDNA高通量测序，随后对分类贡献大的细菌标志物构建随机森林分类筛选，结果发现包括链球菌属、韦荣氏球菌属、殊异韦荣氏球菌、小韦荣球菌在内的20个分类单元与儿童龋齿相关联。因此，龋齿并非单一细菌种类导致，而是一个“群落社区”的作用结果。值得注意的是，在唾液和牙菌斑中，富含的致龋微生物主要由普雷沃菌属组成，这与在患龋儿童和患龋成人中的观察结果一致。
研究还发现，口腔微生物群变化最剧烈的时期发生在儿童患龋早期，而不是在龋齿发展过程中。龋齿的影响因素包括以下几个方面。
2.1牙菌斑生物膜
牙菌斑生物膜是一种细菌性生物膜，为基质包裹的互相黏附，或黏附于牙面、牙间或修复体表面的软而未矿化的细菌性群体，不能被水冲去或漱掉。它在牙齿表面或齿间隙中生存繁衍，牙菌斑的各种代谢产物会聚集在牙表面，久而久之形成龋齿。通过干预产酸生物膜的生长，一定程度上可抑制龋齿的形成。微生物定植发生在所有可利用的表面，也可以穿透上皮组织和细胞。
在非生物和生物表面上，微生物群落聚集成生物膜，这些有机体能更紧密地与唾液膜覆盖的牙齿结合，通过多种机制，包括产生碱、细菌素和过氧化氢，显示出更快速的生长和对抗病原体的能力，有助于维持微生物稳定性。然而，当生态扰动超过阈值时，物种间的竞争改变，致病过程就会被触发。特别是过度暴露于可发酵的碳水化合物，会破坏共生体和病原体之间的平衡，导致低pH胁迫并诱导破坏性的炎症反应。
2.2饮食
食物中的糖类含量变多是引发龋齿的因素之一，因为碳水化合物如葡萄糖和果糖可被用来合成葡聚糖和果聚糖，并被有效地发酵以产生有机酸（如乳酸），这对口腔生物膜的结构和组成有很大的影响。这些酸性物质长时间停留在牙齿表面会导致牙齿硬组织溶解，发展成龋齿。反过来，这种酸性微环境以促进龋齿发展的方式塑造了群落的组成和代谢活动。因此，可通过饮食造成局部酸性微环境来调节口腔微生物群的生态和多微生物协同作用。乳牙的钙化程度低，牙釉质和牙本质均比恒牙薄，耐酸能力差，牙体组织在酸的作用下更容易患龋而且发展更快。所以饮食对儿童龋齿的影响比成人高。
2.3宿主
宿主本身对龋齿的敏感性会涉及到很多因素，例如唾液的流量与流速对细菌造成的机械剪切力，牙龈形状与牙齿排列等。同时，良好的口腔卫生环境会降低龋齿和其他口腔疾病的风险。
3.宿主防御体系
3.1细胞外基质（extracellular matrix，ECM）
虽然口腔微生物群落是龋齿发生和发展的重要因素，但ECM在微生物集体行为和毒力中的重要性正日益被认同，它是生物膜形成和微生物间相互作用的必要条件。ECM是由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质，其构成复杂的网络结构，支持并连接组织结构，调节细胞的生理活动。ECM参与了表面黏附、细胞间相互作用、抗菌耐受等功能。镶嵌在致龋生物膜基质中的微生物具有黏性和黏附性，使得这些生物膜很难从表面去除。此外，ECM可起到保护抗菌素的作用。
ECM也能通过形成化学或营养梯度（如pH和氧化还原梯度）来影响微生物的行为和生存。ECM葡聚糖提供内源性糖的来源，可以直接捕获质子以帮助生物膜内酸的积累。因此，ECM提供了一个多功能的平台，将细胞组织成一个有凝聚力的多细胞生态系统，促进黏附并在空间上定位酸性代谢产物。
3.2炎症反应
牙龈卟啉单胞菌是一种非酵解糖的革兰阴性厌氧球杆菌，是研究广泛且证据充足的重要牙周致病菌之一。牙龈卟啉单胞菌可削弱先天性白细胞的杀菌活性，同时促进其炎症反应。这种双重颠覆性作用在小鼠身上得到了证实，它破坏了宿主微生物的稳态，并导致菌群的出现和牙周炎的发生。在人和小鼠中性粒细胞中，牙龈卟啉单胞菌启动C5aR1-TLR2串扰信号，将宿主保护性TLR2-MyD88途径与TLR2-MyD88-adaptor-like（MAL，或称为TIRAP）-PI3K途径分离，后者阻断吞噬并促进炎症。
牙龈卟啉单胞菌还可绕过MyD88，在巨噬细胞中诱导促炎和抗吞噬TLR2-PI3K信号，即使在牙龈卟啉单胞菌细胞内，PI3K信号也会抑制吞噬体成熟，从而促进其细胞内存活。与牙龈卟啉单胞菌诱导的炎症中MyD88的削减角色一致，无论MyD88的存在与否，这种细菌都会导致小鼠炎症性骨丢失，但TLR2必不可少。牙龈上皮细胞表达IL-8（也称为CXCL8）是健康牙周膜的一个稳态特征，因为它与牙齿相关生物膜相邻，并产生了中性粒细胞向牙龈缝隙募集的趋化梯度，而牙龈卟啉单胞菌选择性地抑制IL-8和T辅助细胞1（TH1）的表达。
4.结论与展望
测序技术的进步与生物信息学算法的升级，提高了口腔微生物群落结构的鉴定能力，而生物标志物也成为了疾病预防与治疗的潜在手段。尽管我们对口腔微生物多样性的认识在过去十几年里取得了长足的进步，大量研究证明牙菌斑和唾液的微生物组不仅与口腔疾病有关，与呼吸系统、心血管系统和消化系统疾病都有关联，但仍有许多领域需要进行更精细的研究，以便更好地进行风险评估和诊断，特别是在人类生命的早期发育阶段。按照这个思路，如果超越这种相互关联，从机制层面探索到因果关系，那么还需要更多的研究积累作为支撑，无论是增加样本量、优化技术，以及管理数据库。
研究者们已经在整理和识别口腔微生物标记，如Human Oral Microbiome Identification using Next-Generation Sequencing（HOMINGS）（https：//forsyth.org/）数据库中有从口腔细菌物种水平上收集的序列，使研究人员能够在高度多样化的口腔生态系统中准确地进行标记鉴定；也有未经鉴定和培养的口腔微生物的综合数据库如the Human Oral Microbiome Database（HOMD）和Core Oral Microbiome Database（CORE）。
随着微生物学和基因组学领域在方法标准化方面取得重大进展，儿童口腔疾病风险评估和预测的机会将显著提高。龋齿的预防需要多种策略综合应用。首先，阻止致病性生物膜积聚或破坏已建立的生物膜，并减少釉质矿物的溶解。其次，目前的抗菌药物中尚无针对生物膜结构和功能的特异性药物，使得药物预防龋齿的临床疗效有限。这需要特别针对生物膜基质、酸性pH微环境和产酸相关的微生物等因素，制定更有效的预防策略，以促进矿化或机械去除不良生物膜，或预防致病性生物膜的形成。
庆幸的是，新型纳米技术的出现应对了渗透生物膜的诉求，并能加快酸性pH下的药物释放，可以提高目前和未来针对致龋生物膜的化学方法的疗效，同时，纳米催化剂可促进变形链球菌生物膜基质降解并增强细菌杀伤力以抑制体内龋齿。此外，宿主调节是一种间接的抗菌方法，因为靶向抑制炎症通路可能破坏生物合成障碍与炎症之间的因果关系，从而恢复有利于与牙齿健康一致的微生物的生态条件。
