软硬组织缺失修复面临着难以完全恢复结构和功能的问题。随着再生医学与组织工程技术的进展，组织再生或许会成为今后治疗这类疾病的研究方向。牙源性干细胞作为存在于牙与牙周组织中的成体干细胞，具有取材容易、较少涉及伦理争议等优点，在组织工程中具有广阔的前景，尤其是在牙、骨骼与牙周组织的再生医学中。
牙源性干细胞属于间充质干细胞，其来源于胚胎时期的神经嵴细胞。神经嵴间充质来源的干细胞在牙胚形成阶段分化为牙乳头干细胞和牙囊干细胞。细胞在不同微环境及上皮-间充质相互作用下分化，最终形成牙髓、牙本质及牙周组织。牙乳头干细胞分化为牙髓细胞和成牙本质细胞，主要参与牙发育。而牙囊干细胞则包裹在牙胚外，可以分化为牙周膜细胞、成牙骨质细胞等，参与牙支持组织的发育。
牙源性干细胞是从牙或牙周软组织分离培养的成体干细胞，根据其来源不同，分为牙乳头来源和牙囊来源2类。牙乳头来源的干细胞主要有牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、脱落乳牙干细胞（stem cell from human exfoliated deciduous teeth，SHED）、根尖乳头干细胞（apical papilla stem cells，SCAPs）。而牙囊来源的干细胞则有牙囊前体细胞（dental follicle progenitor cells，DFPCs）、牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）等。除此之外，有一类新发现的牙龈来源间充质干细胞（gingival mesenchymal stem cells,GMSCs），也有实验表明，其具有多能性和很强的增殖能力，可以参与到大鼠下颌骨缺损修复中。
成体及胚胎干细胞的自我更新和分化能力，是以染色质状态、转录调节和表观遗传修饰紧密合作所形成的调节网络为基础的。表观遗传调控是指即使DNA序列不改变，基因的表达也可能发生改变。表观遗传调控具有广泛性和普遍性。研究证实，表观遗传调控参与诸多生物学过程，包括胚胎形成、生殖细胞形成、造血干细胞分化、肿瘤形成等。
表观遗传修饰功能的逐渐揭示，有助于我们深入理解许多干细胞中的基因表达水平动态变化。正如Townsend等观察同卵双胞胎时发现，mRNA的翻译受影响会导致牙齿形态有显著差异，表观遗传调控在牙源性干细胞的调控中也起到重要作用。研究表观遗传调控牙源性干细胞的机制，可能为牙与牙周组织再生提供一定理论基础。
1.常见表观遗传调控方式
常见的表观遗传修饰主要有DNA甲基化、组蛋白尾部氨基酸残基的修饰及非编码RNA（noncoding RNAs,ncRNAs）的转录后调控。由于目前与牙源性干细胞有关的研究主要集中在一些经典的修饰上，所以我们主要对近年来有研究的修饰作一综述。
1.1DNA甲基化
DNA的碱基序列不仅可以储存遗传信息，还可以通过甲基化修饰来调控基因表达。DNA甲基化主要是胞嘧啶-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸的胞嘧啶转化为5'-甲基胞嘧啶（5-Methylcytosine，5mC）。甲基化CpG水平主要受DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）和DNA去甲基化酶（ten-eleventrans location，TET）蛋白协同调控。
CpG在人类基因组中分布不均，集中分布的区域称为CpG岛，约70%的基因近端启动子中含有CpG岛。CpG岛一般处于低甲基化水平，甲基化水平升高会导致稳定的基因沉默。而CpG调控基因表达的机制主要为2方面：①甲基-CpG结合蛋白家族（Methyl CpG-binding protein family）特异性识别并结合甲基化CpG结构域，抑制DNA的转录。②CpG的甲基化本身可能会阻止转录因子与启动子结合，从而抑制转录。
1.2组蛋白修饰
组蛋白是真核生物的细胞核中与DNA结合存在的碱性蛋白质，与DNA组成染色质基本结构核小体。组蛋白的尾部的氨基酸残基可以被多种基团修饰，从而调控基因的表达。常见的修饰包括甲基化、乙酰化、泛素化和核糖基化等。
1.2.1组蛋白乙酰化修饰
组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyltransferases，HATs）将乙酰基从乙酰辅酶A转移到组蛋白尾部的氨基酸残基。组蛋白乙酰化会提高组蛋白与DNA之间的亲和力，使染色质构象变得宽松，因而转录因子更容易与DNA结合，促进基因表达。组蛋白脱乙酰基酶（Histone deacetylases，HDACs）可以使组蛋白尾部氨基酸去乙酰化。组蛋白去乙酰化通常会引起染色质的浓缩，并导致基因沉默。HDACs对组蛋白乙酰化水平的调控，在干细胞的分化和维持中起重要调控作用，但影响因乙酰化位点不同而相异。
1.2.2组蛋白的甲基化修饰
组蛋白甲基化是由组蛋白甲基化转移酶（histone methyltransferases，HMTs）催化甲基转移到H3、H4组蛋白尾部的精氨酸或赖氨酸。基因表达或抑制取决于HMTs催化的特定残基，常见如组蛋白H3-赖氨酸4（histoneH3-lysine4，H3K4）甲基化可促进基因表达，而H3K9和H3K27则起抑制作用。
组蛋白脱甲基酶有多个家族，它们作用于不同的底物并在细胞功能中发挥不同的作用。比如，KDM1A【lysine(K)-specificdemethylase1A】是最早发现的组蛋白去甲基化酶，可以作用于单甲基化和二甲基化的H3K4和H3K9，其缺失会影响胚胎干细胞的增殖和分化，也在癌症的进展中起作用。
1.3非编码RNA
目前已知的RNA中，仅有2%~5%的RNA能编码蛋白质，其余的RNA称为ncRNAs。一些ncRNA通过调控RNA来调节干细胞的基因表达，影响其多能性、自我更新和分化过程。
1.3.1MicroRNA（miRNA）
这是一类约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，使mRNA分子通过以下1种或几种过程被沉默：①将mRNA链剪切成2部分；②缩短其mRNA的稳定性聚腺苷酸尾[poly（A）tail]；③降低mRNA的翻译效率。
1.3.2内源竞争RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA）CeRNA是一个与miRNA相对的概念，可以竞争性结合miRNA，从而解除miRNA的抑制作用，间接调控基因表达。包括：①环状RNA（circRNA），这是一种封闭环状结构的RNA，富含竞争性结合miRNA的位点，又称为miRNA海绵（miRNA sponge），在细胞增殖、分化和凋亡过程的转录后调控中起关键作用；②LncRNAs，是核苷酸的数量大于200个的ncRNAs，不仅能将蛋白质复合物定位到DNA，导致位点特异性的基因表达改变，还可以作为ceRNA发挥作用。
2.牙乳头来源干细胞的表观遗传调控
牙乳头来源的干细胞，虽然不同种类之间可能存在增殖速率和多能性上的差异，但是基本都具有向类成牙本质细胞分化的能力，目前研究主要集中在这类细胞的成牙本质方向分化调控，所以这里归为一类来综述。DNA甲基化通常导致基因表达抑制。而不同细胞中的DNA甲基化水平不同，分布有差异，这种DNA甲基化图谱差异导致干细胞分化潜能不同。如小鼠磨牙胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor 2，Igf2）和DLK1（delta-like 1 homolog）启动子CpG岛甲基化水平高，其表达受抑制。
通过DNMT抑制剂抑制DNA甲基化，可以降低相关蛋白甲基化水平，促进其表达。使用DNMT抑制剂5-Aza-CdR（5-Aza-2'-deoxycytidine）处理DPSCs，发现牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）、OSX、RUNX2（runt-related transcription factor 2）、DLX5（distal-less homeobox 5 gene）的表达上调，细胞成牙本质方向分化能力提高，而向骨骼肌细胞分化受抑制。而TET水平受抑制，会导致相关基因甲基化水平升高，表达受抑制。例如，TET1减少会抑制DPSCs的增殖和成牙本质分化。
组蛋白乙酰化修饰参与DPSCs多能性的调控。p300（一种高度保守的HATs）可以调控DPSCs中多能性相关基因NANOG、SOX2及OCT4。过表达p300会抑制成牙本质分化，表现为Dspp、Dmp1、骨桥蛋白（osteopontin，Opn）和骨钙素（osteocalcin，OCN）的mRNA水平降低。敲除p300会使DPSCs细胞周期停滞在G0/G1期，增殖和成牙本质分化受抑制，这种分化抑制可能是通过DSPP的蛋白乙酰化调节的。而抑制HDACs可表现为成牙本质分化能力提高。
Wang等发现沉默HDAC6会使DPSCs促进成牙本质向分化和矿化。而使用HDAC抑制剂也可造成相似的影响，如LMK-235处理DPSCs，可以促进增殖、迁移和黏附。不同的组蛋白甲基化修饰可以单独起作用，也可协同作用，而甲基化水平的稳定依赖于相关酶调控。Li等抑制Zeste基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2,EZH2，一种HMTs）使H3K27me3水平下调，导致β-连环蛋白（β-catenin）在DPSCs中堆积，激活Wnt经典信号通路促进DPSCs矿化。相反，抑制H3K9me2会负向调控成牙本质分化。
Kamiunten等构建“Sox9-Cre;G9afl/fl小鼠”条件性敲除牙间充质中的H3K9甲基转移酶G9a，观察到牙间充质增殖减弱，3周龄小鼠磨牙变小，未形成根分叉。而在DPSCs中，去甲基化酶JMJD3可以调控WNT5A启动子附近的H3K4me3和H3K27me3的二价修饰，它们协同调控WNT5A表达，调控DPSCs分化。
去甲基化酶也可以影响DPSCs和SCAPs的分化。如KDM6B减少会抑制成牙本质分化，随后过表达KDM6B可以挽救这种改变。其机制是KDM6B催化骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP2）启动子附近的组蛋白H3K27me3去甲基化，激活BMP2表达，促进分化。miRNA通过影响相关mRNA来抑制基因表达，通过miRNA的靶基因可以预测其调控作用。miR-143和miR-145能通过Klf4-Oxs轴调控成牙本质细胞系和牙本质形成。miR-143-5p和miR-140-5p分别通过抑制p38-丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和WNT/β-catenin信号通路抑制DPSCs分化。
相反，还有一部分miRNA通过抑制降低分化潜能的基因来促进分化。miR-146a-5p抑制NOTCH1和HES1的表达，促进DPSCs分化，抑制增殖。miR-338-3p、miR-218也可通过抑制Runx2的表达促进DPSCs分化。此外，microRNA还能间接调控组蛋白乙酰化来影响牙髓干细胞。
Gu等指出，在牙髓间充质干细胞的衰老过程中，miR-152上调能抑制sirtuin7（SIRT7，一种HATs）的表达，影响组蛋白乙酰化程度。lncRNA可以直接或间接通过miRNA参与牙髓细胞、牙髓干细胞的分化，影响牙本质的形成和牙根的发育。直接作用的，如长链非编码RNA分化拮抗非编码RNA（lncRNADANCR），能抑制成牙本质细胞分化过程中Wnt/β-catenin信号通路的动态激活。
LncRNAH19通过S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶（S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase，SAHH）抑制同源盒转录因子（distal-less homeobox 3，DLX3）基因的甲基化和表达，调节DPSCs的成牙本质向分化。而起ceRNA作用的，如lncRNA-CCAT1能直接结合miR-218，提高DPSCs中I型胶原、OPN和OCN的表达，促进牙髓干细胞的增殖和分化。
3.牙囊来源干细胞的表观遗传调控
牙囊来源干细胞不仅可以向类成牙本质细胞分化，还可以向牙周膜细胞、成牙骨质细胞和成骨细胞分化。由于其多能性较强，近年来也受到广泛关注。
3.1牙囊前体细胞的表观遗传调控
虽然目前已有研究指出DFPCs受许多蛋白调控，但对于DFPCs的表观遗传调控研究相对较少。Gopinathan指出，神经嵴间充质细胞向牙囊或牙髓的谱系分化，可能就是表观遗传调控的结果。牙囊可能由于DSPP和DMP1基因受到组蛋白修饰的表观遗传抑制，以及成牙本质诱导时出现的动态组蛋白富集反应与牙髓相区分。此外，在DFPCs中，EZH2可以调控Wnt基因启动子上H3K27me3水平。EZH2敲除可以激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进DFPCs的成骨分化。
除成骨分化外，组蛋白乙酰化还能调节DFPCs向心肌细胞分化。如HDAC抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA），可以诱导DFPCs体外向心肌细胞分化，这些诱导的心肌细胞中心肌标志物在mRNA和蛋白水平上均有表达。也有学者指出ncRNAs参与调控DFPCs的分化。Chen等认为miR-146a与RUNX2基因之间的相互作用可能是DFCs分化的关键调控机制之一，而上调miR-101后，也可以使DFPCs矿化能力增强，且典型成骨转录因子如Osx表达上调。此外，敲除lncRNAMEG3后，DFPCs的成骨分化能力提高。
3.2牙周膜干细胞的表观遗传调控
牙周膜干细胞来源于牙囊细胞的一类成体干细胞，主要分离自牙周组织。由于可能参与到牙周组织的再生治疗中，PDLSCs得到了广泛的研究。Ai等通过分析DPSCs、DFPCs和DPLSCs的全基因组甲基化图谱后，发现PDLSCs具有更高的成骨相关因子转录水平，更高的体外成骨潜能及更高的体内新骨形成能力，这是由于成骨相关的基因甲基化水平不同。通过使用5-Aza-CdR处理PDLSCs，可以促进其骨向分化，并提高矿化能力。组蛋白乙酰化修饰往往与炎症下的PDLSCs调节有关。
在炎性条件下，HDAC9损害了PDLSCs的成骨分化能力，使用HDAC抑制剂可以将炎症性PDLSCs的成骨分化能力恢复到与健康PDLSC相似的水平。慢性牙周炎症会降低PDLSCs中组蛋白乙酰化酶MORF的表达。而甲氧基欧芹酚（Osthole）会上调PDLSCs中的MORF，催化H3K9和H3K14的乙酰化，可以调节炎症性PDLSCs的成骨分化。使用丙戊酸（valproic acid，VPA）处理PDLSCs，可以通过调控P53相关途径，影响细胞的增殖和分化。GCN5通过对H3K9和H3K14进行乙酰化来调节DKK1的表达，从而影响Wnt/β-catenin通路，调控PDLSCs的成骨潜能。
此外，HDAC6可以通过p27Kip1的乙酰化调节在PDLSCs衰老中起重要作用，抑制HDAC6会加速PDLSCs衰老，并使成骨分化减少且迁移能力降低。组蛋白甲基化同样可以调控牙囊来源的干细胞。Wang等在PDLSCs中敲除KDM6A，发现SOX基因的H3K27me3水平增加、H3K4me3降低，使细胞的软骨向能力减弱。而使用EZH2抑制剂调节H3K27me3，可以部分挽救成软骨潜力。
Han等发现，BCL-6共抑制因子（BCL-6 corepressor，BCOR）可以与KDM6B形成复合物，在IGFBP5启动子中提高组蛋白K27甲基化水平，从而促进PDLSCs的成牙本质分化、增殖、迁移及矿化能力。在PDLSCs的成骨分化中，miRNA可以起到促进或抑制作用。比如miR-23a可能以BMPR1B为靶基因，其过表达会抑制Smad1/5/9的磷酸化，从而抑制PDLSCs的成骨作用。
与之类似，miR-132可以抑制GDF5，激活NF-κB轴，进而抑制PDLSCs成骨向分化。此外，miRNA也可以调控炎症因子。如miRNA-146a可能通过下调白介素-17（interleukin-17，IL-17）和IL-35的表达，抑制人PDLSC的增殖，影响分化。miRNA还能协同组蛋白乙酰化参与PDLSCs调控。Yan等发现miR-22可以抑制HDAC6表达，促进PDLSCs的成骨分化。circRNA和lncRNA都可以作为ceRNA来抑制miRNA，间接调控PDLSCs的成骨分化。
circRNA3140与miR-21，小脑变性相关蛋白1转录本（cerebellar degeneration-related protein 1 transcript，CDR1as）与miR-7能协同作用，调控PDLSCs的成骨分化。lncRNA-ANCR竞争性结合miR-758，对PDLSCs的成骨分化起抑制作用。
另外，一种在牙周炎患者中发现的lncRNA-POIR可能作为miR-182的ceRNA，抑制碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、RUNX2和OSX的表达，进而抑制PDLSCs成骨。由于表观遗传修饰种类繁多，机制各异，所以对于表观遗传的调控作用的研究只是冰山一角。我们了解到DNA、组蛋白修饰及ncRNAs都可能通过独立的或者相互作用的方式，参与到牙源性干细胞的表观遗传调控中，从而影响增殖、分化、凋亡及行使功能。但是现阶段对于牙髓干细胞的表观遗传研究还有所欠缺。
目前研究还聚焦于较为经典的表观遗传修饰及修饰位点。随着新的表观遗传修饰功能的不断揭示，这些修饰在真核生物中广泛存在，所以也同样可能在对牙发育相关的过程中起到调控作用。如DNA的6mA修饰、mRNA的m6A修饰以及tRNA上丰富的表观遗传学修饰。表观遗传调控的研究进展迅速，其调控功能并不会改变遗传信息，或许一些修饰位点能成为再生医学的靶点而发挥作用。
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