口腔微生物与口腔鳞状细胞癌关系的研究进展

2021-1-3 15:01  来源:中国口腔颌面外科杂志
作者:刘塬 张凌 阅读量:1220

    口腔微生物群落是指定植于人体口腔的微生物集合。口腔中有超过700种微生物定植,是人体最复杂的微生物群落之一。健康成人体内的细菌数量至少是人体细胞数量的10倍。人类微生物组用来定义人体存在的所有微生物。人类自身的数十万亿细胞所携带的遗传信息,构成了人类的“第一基因组”;而每个个体携带超过10000种、总量数十亿的微生物遗传信息的总和,构成了人类的"第二基因组",即人体微生物组,主要包括细菌、真菌和病毒等,细菌占主体地位。

    目前发现一些癌症的发生和微生物存在相关性,这就让我们思考口腔微生物和口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的关系。OSCC通常在较晚期才被发现,尽管在手术、放疗和化疗方面取得了进展,但仍然未达到满意的疗效。OSCC的主要危险因素包括吸烟、嚼槟榔、大量饮酒等,但是约15%的口腔鳞癌不能用上述主要危险因素来解释,需要探索其他潜在的危险因素。由于牙和硬组织的存在,口腔不同于其他菌库,口腔几个独特的解剖结构为微生物(主要是细菌)的繁殖提供了有利条件和营养。每个生态位置(如硬腭、软腭、舌背以及牙表面)都显示出不同的细菌特征。

    口腔微生物群落的稳定,形成口腔微生物稳态,与宿主呈现共生互利关系:宿主为微生物群落提供繁衍生息的环境;微生物也可以保护宿主,因为它们在特定的表面定植,防止病原菌粘附或阻碍病原菌的生长。

    1.口腔微生态系

    微生态系是指在一定结构的空间内,正常微生物群以宿主组织和细胞及其代谢产物为环境,在长期进化过程中形成的能独立进行物质、能量及基因相互交流的统一的生物系统。口腔微生态系(oral microecosystem)由两部分组成,包括口腔组织器官和存在于口腔的各种微生物。口腔微生物组(oral microbiome)(亦有称为口腔微生物群落,oral microflora或oral microbiota)包括超过600种细菌、真菌及病毒、支原体、衣原体,其中以细菌为主,各种微生物和宿主形成动态平衡,维持其稳态的存在。

    2.细菌与口腔癌

    目前在细菌和口腔癌的关系上,学者们存在2种意见,一是认为某些细菌具有强致病性,可以导致口腔癌的发生或发展;另一些学者认为口腔菌群改变是由于肿瘤厌氧微环境导致。前者主要针对某一种致病菌进行研究,后者的研究多从整体上关注菌群丰度的变化。

    事实上,由于菌斑是口腔微生物增殖、活动的基础,仅依靠提取单一细菌进行培养来探讨其对口腔健康的影响存在偏颇,某一细菌的活动可能在菌斑微生态中受到抑制,而在体外培养难以完全复制这种情况。值得注意是,我们往往关注毒力较强的细菌,而毒力小的细菌可能在数量上具有优势,从而在菌斑形成中起重要作用。当前的OSCC诊断以病理诊断为准,但病理诊断存在其缺陷,如取样的选择和病理分期的界定对临床医师和病理医师提出的要求较高。

    研究口腔菌群,探讨其在OSCC中的作用,有助于OSCC的早期诊断和精准治疗。健康口腔黏膜表面的生物膜中,占主导地位的菌群是需氧菌,在口腔内发现的细菌以链球菌为主,但不同部位的优势菌种有显著差异,而牙菌斑是链球菌的主要生存环境之一。分析口腔鳞癌患者的口腔菌群,其组成表现出差异。

    Hooper等从口腔鳞状细胞癌深部分离出活菌,发现肿瘤的微生态环境有利于细菌定植和存活。临床上发现,口腔癌患者的口腔卫生状况较差,口腔卫生状况与口腔肿瘤具有相关性。有研究显示,刷牙次数增加和口腔检查增多,可减少患口腔癌的可能性。益生菌对健康的影响也越来越受重视,益生菌可能通过增强免疫和调节菌群来减少口腔疾病的发生。牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌与胰腺癌和直肠癌存在相关性,也是菌群致癌的重要研究对象,可能与口腔癌存在相关性。

    牙龈卟啉单胞菌感染是牙周炎的病因之一,可能在口腔癌的发生中起到某种作用。有研究指出,牙周炎中牙槽骨丧失,罹患头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)的风险比值比(OR)=4.36;当按特定头颈部位置统计时,这种关联在口腔中的强度略高,为OR=4.52。在癌症组中,出现了以梭杆菌为中心的关联网络,表明梭杆菌属在癌症组中显著增加,与OSCC的发生、发展存在相关性。梭杆菌通过在早期和晚期定植之间架起桥梁,在菌斑中与其他物种共存。一些类群所占的比例较小,但在鳞癌发生中的作用不容忽视。在结直肠癌中,艾肯菌属的比例明显升高,且与HPV阴性的HNSCC样本存在相关性。鉴于其致病性,进一步研究艾肯菌在OSCC病因中的潜在作用很有必要。

    2.1细菌致癌机制

    细菌被认为通过调控细胞凋亡、激活细胞增殖、促进细胞侵袭、诱导慢性炎症和产生致癌物等促进口腔癌变。

    (1)调控凋亡:牙龈卟啉单胞菌可抑制牙龈上皮细胞(gingival epithelial cells,GECs)原代培养细胞凋亡,其机制可能多种多样,如抑制ATP配体与同P2X7受体结合,引起牙龈上皮凋亡。然而也有研究表明,牙龈卟啉单胞菌可促进细胞凋亡,可能与实验中该菌与细胞共培养时间长短有关。

    (2)激活细胞增殖:最近的研究表明,长期感染条件下,牙龈卟啉单胞菌可通过调整细胞周期,促进细胞增殖;还可影响炎症因子表达,并改变细胞形态学。牙龈卟啉单胞菌可加速GECs增殖过程,通过上调细胞周期S期和G1期细胞周期蛋白(D和E)实现,促进S期到G1的转变。

    (3)促进细胞侵袭:基质金属蛋白酶(MMPs)是细胞侵袭的重要证据。研究表明,牙龈卟啉单胞菌激活ERK1/2-Ets1、p38/HSP27、PAR2/NF-kB等通路,诱导proMMP9表达;随后酶原被激活,促进OSCC细胞株的细胞侵袭。也有研究发现,牙龈卟啉单胞菌通过上调IL-8和MMPs,增加口腔癌细胞的侵袭性。牙龈卟啉单胞菌可通过上皮-间充质转换(EMT)增加OSCC的侵袭性,上皮细胞在牙龈卟啉单胞菌存在时获得上皮-间充质转化表型,而这种转换是肿瘤转移的关键机制。此外,具核梭杆菌能够结合宿主来源的蛋白水解酶(如基质金属蛋白酶),从而增强细胞的侵袭能力。

    (4)诱导炎症:慢性感染可导致癌症发生,全球约16%的癌症负担直接归因于感染因素。由感染或环境暴露引起的慢性炎症,在包括诱导、进展、侵袭和转移在内的癌症发生的所有阶段都发挥着关键作用。微生物病原体可引起许多癌症中观察到的慢性炎症,口腔病原菌诱导宿主炎症反应,其特征是细胞因子、趋化因子和生长因子增加,这些因子促进细胞存活和增殖,从而有助于癌症发生。

    炎症细胞因子被认为通过诱导突变、基因组不稳定性和表观遗传学改变而促进癌症发生,炎症细胞因子激活癌前细胞内的STAT3、NF-kB等关键因子,促进包括增殖、血管生成、侵袭和转移在内的恶性过程。因此,慢性炎症被认为是细菌促进口腔癌变的潜在途径之一。这也为牙周炎和OSCC高风险之间的紧密联系提供了一个合理的解释,一些口腔细菌具有促炎潜能,在GECs和OSCC细胞系中,牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的巨噬细胞调节头颈癌细胞的增殖和侵袭。

    在体外培养的OSCC细胞系中,牙龈卟啉单胞菌可增加IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α表达;此外,牙龈卟啉单胞菌感染可能参与IL6、STAT1、LYN、BDNF、C3、CD274、PDCD1LG2、CXCL10基因造成突变引起的口腔癌的发生与发展。微生物及其产物(内毒素或酶)的反应引起的炎症,以及直接DNA损伤(由活性氮、活性脂类、代谢物或金属蛋白酶引起),可以调节肿瘤微环境并影响细胞增殖,这些反应构成有害刺激,驱动肿瘤发生。在肿瘤部位的毒力因子表达中,梭杆菌是主要的毒力因子表达类群,以具核梭杆菌为中心的微生物间的相互作用,在OSCC的发展中起着重要作用。梭杆菌属可在人体黏膜及其他部位发现,但是具核梭杆菌被认为是一种机会致病菌,与肿瘤的发生关系密切,如结直肠癌。

    2012年的2项研究,在尝试确定结直肠癌组织的基因组和转录组特征的过程中,研究人员第1次在人类核酸中观察到梭杆菌DNA或RNA。在口腔内,具核梭杆菌存在于牙菌斑中,而长杆状的具核梭杆菌在这种微生物菌落形成过程起着重要作用。在牙周炎中,具核梭杆菌可与牙龈卟啉单胞菌相互作用,促进炎症进展。牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌突破上皮屏障后,可以通过toll样受体与口腔上皮细胞直接相互作用,产生慢性炎症,促进口腔癌进展;具核梭杆菌还可增加促炎因子IL-6、IL-8的产生,以及抑制免疫细胞的作用。

    (5)产生致癌物:口腔中的某些细菌例如唾液链球菌和真菌具有乙醇脱氢酶(ADH),可在有氧或微氧条件下催化产生乙醛。乙醇本身不是致癌物,但其代谢物乙醛、羟基乙基自由基和羟基自由基都是致癌物。国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer)将与饮酒有关的乙醛列为人类的第一类致癌物,其能导致姐妹染色单体交换、点突变、DNA加合物和上皮细胞过度增殖。微生物的几种抗原组分,包括脂多糖(LPS)、肽聚糖、脂壁酸和碳水化合物抗原,可以触发巨噬细胞产生一氧化氮(NO),这些细菌抗原组分诱导的NO过量产生,可能会损伤宿主DNA、促进肿瘤发生。

    有学者在OSCC标本中特异性检测到咽峡炎链球菌,可通过诱导NO和COX-2合成,导致DNA损伤率增加,从而导致受感染组织发生癌变。然而,Morita等仅在13%(5/38)的OSCC样本中发现了咽峡链球菌,提示该细菌并非导致OSCC的关键因素,需要进一步探讨其在口腔鳞癌中的作用。

    2.2口腔鳞癌组织内的细菌

    口腔鳞癌组织内的细菌研究涉及肿瘤微环境。与正常组织间不同的是,肿瘤细胞间是低氧、低pH值环境,可能是由于肿瘤细胞代谢速度以及局部血供不足造成。在此条件下,微生物组成可能表现出特异性。Pushalkar等研究了10个OSCC样本中细菌群落的组成,并与同一患者5cm外切除的正常组织进行比较。样品经过处理后,除组织内的细菌外,还包括所有表面细菌,发现唾液链球菌、格氏链球菌、溶血孪生球菌、麻疹孪生球菌、懒惰约翰森菌属和副血链球菌I与肿瘤部位呈高度相关性,而毗邻颗粒链球菌在非肿瘤部位普遍存在,70%的非肿瘤部位和肿瘤部位存在中间链球菌。

    Hooper等利用荧光原位杂交和16SrRNA测序技术,从肿瘤组织中分离出52种不同的细菌系统类型,包括变形杆菌、梭杆菌、链球菌、普雷沃菌和细孔菌。通过甜菜碱浸泡从组织样本中去除所有表面细菌,分析局限于组织内的细菌。虽然在细菌组成方面未发现显著差异,但注意到与来自相邻组织的对照样本相比,肿瘤内包含密执岁棍状杆菌、舟型梭杆菌和危险罗尔斯通菌;对照样品显示毗邻颗粒链球菌、牙龈卟啉单胞菌、鞘氨醇单胞菌、轻型链球菌和口腔链球菌的分离株。

    Wang等对单个肿瘤和正常组织进行配对分析,发现放线菌属的相对丰度存在显著差异。这些差异在疾病进展患者中更为明显,与高分期(T3、4)患者相比,低分期(T1、2)患者的放线菌属相对丰度显著增加。同样,另一项研究表明,拟杆菌门和放线菌门的数量也随着癌症从Ⅰ期到Ⅳ期的进展而显著减少,OSCCⅣ期样品与健康对照组相比,梭杆菌属增加,链球菌属、嗜血杆菌属、卟啉单胞菌属、放线菌属减少。有趣的是,病变中显著富集的菌属大多数与牙周疾病存在相关性,包括梭杆菌、小杆菌、消化性链球菌、产线菌、消化性球菌、卡氏菌和微单胞菌等。

    2.3口腔癌表面的细菌

    口腔鳞癌常表现为外生型及溃疡型,表面坏死组织为微生物提供了良好的生存环境。有研究表明,使用抑菌洗液冲洗口腔鳞癌表面,有助于减轻患者的不适症状。Nagy等收集21例病变中心表面和相邻健康黏膜的微生物样本,进行体外培养。与同一患者健康的黏膜表面相比,口腔鳞癌伴表面溃疡者表面微生物含有大量的需氧菌和厌氧菌,牙龈卟啉单胞菌增加明显。

    Schmitt等研究了13例患有OSCC或癌前病变的患者以及正常人的黏膜细菌群落,比较同侧病变和对侧对照黏膜,在OSCC和癌前期患者微生物组中,代表厚壁菌门的链球菌和代表放线菌门的罗氏菌显著减少,代表梭杆菌门的梭杆菌显著增加。口腔扁平苔藓作为一种癌前病变,其菌群变化值得注意。有学者研究扁平苔藓患者的黏膜菌群,发现梭菌属、纤毛菌属和劳特罗普菌属在患侧菌群占比均超过5%,其链球菌丰度小于30%;而健康人群颊黏膜链球菌具有明显的相对丰度(>50%)。黏膜与其表面的细菌组成的微系统是复杂的,黏膜上皮细胞需要在有氧条件下生存,而其表面细菌既有需氧菌又有厌氧菌,目前的实验技术难以完全复制该微系统,增加了细菌致癌机制研究的难度。

    2.4唾液中的细菌

    口腔微生物以菌斑形式存在于各部位,如软组织表面;而唾液中的微生物通常被认为由菌斑微生物脱落而来。有研究表明,唾液中的细菌可反映口腔微生物状况。唾液中的微生物组成与口腔软组织表面的菌斑微生物组成更加接近,唾液微生物群有望作为OSCC患者的诊断指标。有学者通过比较正常人、癌前病损患者以及口腔鳞癌患者的唾液样本,发现至少9种细菌(拟杆菌属、梭菌属、埃希杆菌属、粪杆菌属、巨单胞菌属、考拉杆菌属、多尔菌属、布劳特菌属、别样杆菌属)在上皮癌前病变和癌症组中与病损呈正相关。唾液中微生物群落的变化(如芽孢杆菌、肠球菌、微单胞菌、消化性链球菌、斯莱克菌)可能是预测、检测和判断口腔癌预后的标记,特别在上皮细胞癌前病损-癌症转化的过中。

    Mager等使用DNA-DNA杂交技术研究45例OSCC患者和229例无癌对照组中40种常见口腔细菌唾液计数的差异,发现牙龈二氧化碳嗜纤维菌、产黑素普雷沃菌和轻型链球菌在OSCC患者中显著增加;当三者计数≥0.4×105/mL时,其诊断敏感度≥80%。唾液中的微生物组成相对稳定,取材方便,作为疾病标志物,值得深入研究。

    3.真菌和口腔癌

    口腔中最常见的真菌是白假丝酵母菌(也称白色念珠菌,Candidaalbicans),系口腔常驻菌之一。念珠菌病是发生在口腔的念珠菌感染,其表现形式多种多样,常见慢性增生性念珠菌病,有时也称为念珠菌白斑。各种关于念珠菌在口腔癌前病损和肿瘤形成中作用的假说被广泛讨论。研究表明,念珠菌具有产生亚硝胺化合物的能力,而亚硝胺化合物可诱导口腔鳞癌化学诱导模型,念珠菌在促进肿瘤发生方面具有潜在的作用。

    有文献指出,HNSCC患者白色念珠菌丰度大大提高,同时IL-1β和IL-8浓度增加,两者显示出强烈的相关性。IL是引起炎症的重要因子,炎症与癌症的关系已于前述。念珠菌可产生乙醇脱氢酶,将乙醇转化为乙醛;伴有念珠菌感染的口腔白斑,相比其他类型的白斑,具有更高的恶变率。通常认为,白色念珠菌与OSCC有关的特性包括影响上皮细胞定植,产生致癌物,诱导肿瘤发生,诱导上皮癌变,改变微环境,产生慢性炎症等。虽然文献报道中念珠菌与口腔癌早期以及癌症进展之间的联系明显,但其确切机制尚不清楚。

    4.病毒和口腔癌

    病毒参与OSCC的发展已有多项研究,最常被研究的病毒是人类乳头瘤病毒(HPV)、Epstein-Barr病毒(EBV)。

    4.1HPV

    HPV是一组DNA病毒群,目前已鉴定出100多种类型。根据HPV感染的临床表现,HPV可分为高危(HR)型和低危(LR)型。HR-HPV与易于发生癌变的病变存在相关性,这些病毒包括16、18、31、33、35、39、45和52型。HPV常常与宫颈癌联系在一起,宫颈上皮细胞感染特定高危型HPV,在宫颈癌的发生、发展中起着关键作用,可引起前体细胞病变,维持恶性生长。

    HPV-16/18是头颈肿瘤中最常见的HPV亚型,其中HPV-16超过90%。其他类型的HPV占比较少,当然可能与研究方法有关,如仅对选定的HPV类型进行检测。有观点认为,肿瘤患者HPV状态是个体生存和进展的预后因素,也可能是治疗反应的预测指标。HPV感染是口咽癌和口腔癌的重要致病因素,其DNA上有E6和E72个基因,其编码的E6和E7蛋白2条通路参与癌症发生。E6蛋白与肿瘤抑制蛋白p53结合,导致p53泛素化和蛋白酶体降解,最终抑制p53依赖性细胞周期阻滞。E7与retinoblastoma蛋白(pRb)结合,阻止其与E2F转录因子结合,从而使E2F促进细胞进入S期,导致细胞周期进展和恶性转化。此外,pRb功能失活导致p16蛋白过度表达。

    P16蛋白是一种周期依赖激酶(CDK)抑制剂,由CDKN2A位点编码,在G1期阻滞细胞周期。P16蛋白在口咽癌中的阳性率显著高于口腔癌,可作为检测HPV感染的理想替代物。有研究表明,HPV感染造成的OSCC会造成宿主基因组改变。头颈肿瘤患者p53基因表达受限,低表达p53与HPV存在相关性。然而也有学者认为,HPV16感染与p53突变在中国东部人群口咽鳞癌中是2种不同的致病因素。

    HPV是否在OSCC中独立致癌仍有异议,研究证实,HPV-DNA存在于相当数量的OSCC中,但仍有许多未解决问题,如P16蛋白表达和HPVDNA阳性的关系;HPV-DNA阳性OSCC是否由HPV导致,因为HPV-DNA的存在仅意味着HPV感染,并不意味着HPV本身具有生物学活性。有研究表明,患有炎症性肠炎(IBD)的患者进行免疫抑制药物治疗后,发生癌前病损(红斑、白斑、扁平苔藓)、感染HPV和发生口腔鳞癌的机会均增加。

    4.2EBV

    EBV常见于Burkitt淋巴瘤及鼻咽癌,可能在OSCC中发挥重要作用。过去的研究结果不一,与地理分布以及用于检测的样本类型及技术有关。Kobayashi等收集46例OSCC样本,检测到7例含有EBV,且7例患者OSCC分化程度高于其他患者。术后随访表明,EBV阳性患者在预后方面优于EBV阴性患者,提示EBV和OSCC组织分化存在联系。

    有学者发现,EBV与嚼食槟榔有统计学意义上的相关性,咀嚼槟榔可能会增加OSCC中EBV的感染率。然而,Cruz等的实验中,未能在OSCC样本中检测到EBV及其产物,如EBERs、BARF0和LMP-1等;PCR检测到OSCC冷冻标本中存在的EBV-DNA,可能仅反映了唾液中脱落的EBV。目前对EBV和OSCC的研究多集中在两者的关系方面,对EBV导致OSCC的分子机制研究较少,有待进一步深入。

    5.问题及展望

    口腔微生物和口腔鳞癌间关系的研究已取得一定进展,但仍有许多尚未解决的问题,例如能否找到可靠的细菌作为口腔鳞癌标志物,能否完整阐述微生物致癌机制,如何根据微生物变化来预防和治疗口腔鳞癌,以及新技术在研究微生物和OSCC的关系中的应用等。口腔微生物和口腔鳞癌关系密切,相互影响,研究两者间的相互作用,有助于深化对口腔鳞癌的认识,以期实现对口腔鳞癌的三级预防,降低口腔鳞癌的发病率和死亡率。

编辑: 陆美凤

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