先天性唇腭裂是最常见的颌面部发育畸形，全球新生儿患病率约为1∶600～1∶700。临床上约70%为非综合征型唇腭裂（non-syndromic cleft lip with/without palate，NSCL/P），其具体形成原因尚未完全明了，先天缺陷背后的作用机制尚不完全清楚，目前认为是复杂的多基因遗传因素和环境因素共同作用的结果。尤其是在胎儿发育成形的前12周，不管是基因的突变还是外界环境的干扰，最容易导致唇腭裂的发生。
随着基因检测技术的进步及实验研究的深入，已有多个与唇腭裂相关的易感基因位点被研究证实，如干扰素调节因子6（interferon regulatory factor 6，IRF6）、肌节同源盒基因同系物1/2（muscle segment homeobox 1/2，MSX1/2）、成纤维细胞生长因子受体2（fibroblast growth factor receptor2，FGFR2）等。
最近，越来越多的证据表明非编码RNA在生物发育过程中扮演的角色远比以前设想的重要，miRNA被认为是人类腭裂基因的潜在修饰因子，可作为研究腭裂病因机制的一种新手段，是近年来尤为关注的热点。miRNA的基因调控广泛作用于生物发育及疾病发生，具有重要的生物学意义。有研究发现，在动物基因组中，miRNA约调控三分之一的基因，且参与到唇腭部发育的基因信号表达。本文将对miRNA在唇腭裂中的研究进展进行一综述。
1.miRNA的形成与调控机制
miRNA是一种长度大约22个核苷酸（nt）组成的内源性非编码RNA，通过以DNA为模板转录加工形成。成熟miRNA的形成过程如下:首先通过RNA聚合酶的作用，miRNA所对应的基因被转录为初级miRNA（pri-miRNA，primarymiRNA），然后初级miRNA在内切酶的作用下被剪切成带有茎-环结构的前体miRNA（pre-miRNA），上述过程是在细胞核内进行。随后前体miRNA被转运蛋白运送到细胞质中，经过酶的作用加工为成熟的双链复合体，最后其中的一条miRNA链与AGO蛋白结合形成沉默复合体，另一条miRNA链则引导RNA诱导沉默复合体（RNA induced silencing complex，RISC）到达其靶基因，调控其表达。
通常情况下，miRNA的5’端2-8核苷酸位点与其靶基因mRNA的3’非编码区（untranslated region，UTR）完全结合，而其余位点不完全配对，若miRNA与mRNA完全互补匹配，则会导致mRNA降解；若匹配程度较低，则会抑制mRNA的翻译。在真核生物中，每个miRNA可与上百个靶基因相结合，同一mRNA可接受多个miRNA的调控。此外，miRNA还具有时空特异性及微调性，调控近30%的基因，在细胞增殖、凋亡、生长发育及肿瘤等生理、病理活动中至关重要。由此可见，miRNA在基因调控表达上发挥着重要作用。
2.miRNA的生物功能
miRNA的功能繁杂多变，广泛参与到各种信号分子通路中，形成复杂的调控网络，其与生物的生长发育密切相关，从调节生命生理活动到疾病发生转归，都扮演着重要角色。在胚胎的各个发育系统中，例如miRNA在神经系统的构建、神经元细胞的发育，都具有较强的神经活性；同时，miRNA也对多种免疫细胞的分化、增殖及发育进行调节。研究表明，在T细胞不同的发育阶段miRNA有着不同的表达变化。
研究证实miRNA在血液、唾液等多种生物体液中可以无细胞稳定的存在，miRNA表达水平的变化提示可能与人类疾病的发生相关，其作为一种新的分子标记物具有强大的潜在效应。近年来，研究者们对miRNA的探索主要集中于肿瘤癌症等疾病领域。罗彬瑞等发现在喉鳞状细胞癌患者的唾液中，检测到miRNA-205过表达，认为其可作为喉癌的早期诊断，从而避免有创检查；此外，谢子钧等通过提取唾液miRNA应用于食管癌的早期筛查，证明是具有诊断价值的生物分子标记物。因此在miRNA与肿瘤的相关研究可以预见，其对未来肿瘤疾病的诊疗和药物使用都有重大帮助。
目前，先天性发育畸形的患病率仍然很高，但miRNA在胚胎发育方面的报道却较少。研究表明，miRNA对颅面发育有重要的调节作用，异常的基因表达会导致到达额窦区域并形成面部骨骼的神经嵴细胞（neural crest cells，NCCs）数量减少，或导致NCC模式的失败以及向骨骼和软骨的分化，比如从斑马鱼的咽弓、耳囊和躯干肌肉的miR-23b和miR-133b表达分析可见，其表达上调可导致脏器软骨结构异常和明显的面中部裂。显然，miRNA在先天发育畸形领域可待更深的挖掘。
3.miRNA与唇腭的发育
3.1miRNA与唇腭发育的相关信号通路关系
3.1.1与Wnt信号通路之间的关系
目前研究证明，Wnt信号通路是参与胚胎发育的重要信号途径之一，其基因的突变与唇腭裂的发生有着显著关系。同时，miRNA与Wnt基因家族的关联同样密切，有研究报道，显著表达差异的has-miR-1260b，hsa-miR-205-5p，has-miR-24-3p等均与Wnt家族的Wnt5a、Wnt9b、Wnt10a等信号分子靶向结合，而Wnt5a、Wnt9b等基因已被证实可诱导细胞定向迁移、分化，参与调控唇腭部的发育过程。
此外，陈勇龙等研究发现在小鼠胚胎腭间充质细胞（embryopalatal mesenchymal cell，EPMC）的miR-382表达上调后，下游Wnt信号通路的Wnt1、Wnt3等基因出现明显下调，认为miR-382通过调控其靶基因Porcn的下调来作用于Wnt基因的表达，从而影响EPMC的迁移、分化，导致腭板融合失败。
3.1.2与转化生长因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）通路的关系
上皮-间充质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）是腭板融合的重要过程，也是腭形成过程中的关键步骤。研究证实，TGF-β通路可广泛参与腭板的融合过程，其调控的关键因子Smad2和Snail在EMT过程中更是发挥着重要作用，然而在腭部miR-200b过表达后，Smad2和Snail出现表达下调，其介导的EMT作用大幅度减弱，从而导致腭板融合失败。另外，miR-200b还可与ZEB（zinc finger E-box binding protein）因子结合，其表达下调可使ZEB因子促进EMT作用。
Zhang等探讨了miR-106a-5p通过TGF-β/Smad信号通路调节腭裂细胞凋亡和代谢组学变化发现，miR-106a-5p在腭裂组织中的表达增加，与Tgfbr2蛋白水平呈负相关。荧光素酶活性测定进一步证明Tgfbr2是miR-106a-5p的直接靶标，认为miR-106a-5p增加PMC的凋亡水平，可能与其抑制TGF-β信号通路有关。
3.1.3与BMP（bone morphogenetic protein）信号通路的关系
BMP信号通路与唇腭裂的发生密切相关，而且BMP是TGF-β超家族系的成员，其同样作用于下游Smad蛋白，影响EMT过程。研究发现，BMP突变可导致小鼠口面裂的形成，而miR-17-92靶向结合于Smad1/5/8，在其表达上调后调节腭胚间质细胞分化，可促进小鼠口面畸形的发育。可见，BMP信号通路可与miR-17-92相结合，调控其表达，从而参与颌面部的发育。此外，据报道，miR-17-92与E2F家族基因最重要的功能是调节细胞周期和促进细胞增殖，而PMC的正常细胞周期进程和增殖对腭部发育具有重要意义。E2F成员E2F1过表达可以显著增加miR-17-92成员的表达，E2F1和miR-17-92之间存在的负反馈环可能通过调节PMC的增殖和周期参与腭部发育。
3.1.4与SHH（Sonic Hedgehog）信号通路的关系
Shh信号分子作为EMT作用的重要调控因子，受到研究者们的广泛关注。其对胚胎期面突的细胞分化增殖、上皮间充质的转化起到举足轻重的作用。可见Shh的异常表达易导致畸形的发生。在一项对斑马鱼的实验发现，由于Shh信号的接收发生在初级纤毛处，而初级纤毛是传递多种信号分子的细胞感受器，当miR-219功能降低时，会加速初级纤毛的生长，同时升高Shh信号，促进细胞信息交流，调节生理活动。此外，另有研究报道，在对斑马鱼口腔外胚层中的miRNA-140过表达后，会明显抑制信号分子Shha的表达，可见miRNA-140能够通过调节信号分子从而影响到Shh信号通路的传导。
3.1.5与Hippo信号通路的关系
Hippo信号通路同样是胚胎生长发育的重要传导途径之一，对细胞的分化、增殖、凋亡都发挥着重要作用，与唇腭裂的发生具有相关性。但目前对于miRNA与Hippo在唇腭裂领域的相关研究涉及较少。有研究发现，在妊娠第14.5天的小鼠胚胎腭裂模型mRNA-Seq实验中，通过GO和KEGG对差异表达的基因进行功能注释分析、qPCR检测用于验证RNAseq数据，结果表明，淋巴样增强因子1（lymphoid enhancement factor 1，LEF1）和Smad家族成员3（Smad3）显著富集了EMT相关的生物学过程，而且其表达下调通过Hippo信号通路抑制EMT作用，导致腭裂的形成。miRNA与Hippo信号通路之间可能同样具有很深的渊源，但尚需要实验验证。
3.1.6其他
在成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）信号通路中，FGF可以与其受体FGFR特异性结合，进行细胞信息传递，作用于EMT。miRNA-1246、miRNA-93和miRNA-1323在腭裂中出现表达上调，而三者又可调控FGFR2的表达量使其下调，进而影响腭板的融合。此外，在斑马鱼中的miRNA-140可调节血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）介导的神经嵴细胞对口腔外胚层的迁移分化，若其过表达则负调控Pdgf信号，形成腭裂，但是若miRNA-140的功能抑制则会导致腭部形状改变，形成畸形。
不同的信号通路之间并不是独立的，而是相互影响、相互作用，共同参与调节细胞的生理活动。唇腭部组织的生长发育过程复杂严谨，涉及到各种信号通路，形成了庞杂的网络调控系统，因此对调控基因信号的任何微小干扰都可能会造成严重的后果。
3.2唇腭裂患者的miRNA差异表达
3.2.1外周血浆miRNA差异表达
血浆miRNA是近年来出现的一类影响多种生物功能的新型调节分子。研究发现，从外周血提取的血浆miRNA在唇腭裂患者与正常人的对比中有明显的表达差异。在探讨人类非综合征性口面裂（non-syndromic orofacial clefts，NSOC）相关的血浆miRNA实验中，唇裂（cleft lip only，CLO）、腭裂（cleft palate only，CPO）及唇腭裂（cleft lip with palate，CLP）有着重叠又不同的失调miRNA表达谱，提示不同的唇腭裂类型可能有不同的调节机制。通过人类miRNA微阵列数据分析发现，三者共同上调的miRNA有57条，下调的有45条，显著变化的有miR16-2-3p，miR-215-5p，miR-365a-3p，miR-574-5p，miR-584-5p和miR-877-5p等，其共同的关键基因靶点反映了Wnt、Notch、TGF-β和Hedgehog（Hh）信号通路的功能关系，参与多种细胞的分化增殖。
3.2.2血浆外泌体miRNA差异表达
外泌体是一种大多数细胞可分泌的内源性小囊泡，广泛存在于各种生物液中，其包含的核酸具有重要的生物学价值，包括与疾病发生密切相关的miRNA。研究表明，有学者通过miRNA测序筛选出NSCL/P血浆外泌体中表达异常的miRNA，并进行生物信息分析，发现miRNA表达上调的有14条，下调的有4条。其中具有代表性的是miRNA-133a-3p、miR-150、miR-128，而miRNA-133a-3p为Wnt信号通路重要的调节因子，其高表达可能抑制了Wnt的相关基因，导致细胞无法定向迁移、分化。
此外，该学者还在血浆miRNA和血浆外泌体miRNA的差异对比中发现，血浆外泌体中表达上调的miRNA有13个，下调的有3个，而血浆中表达上调的miRNA有170个，下调的有62个。导致这种表达差异原因分析，目前认为是包含在外泌体中的miRNA受外界环境的干扰小，显得纯度及富集程度更高，可以更全面的反映表达情况。
3.2.3唇腭组织与脐带组织miRNA差异表达
miRNA主要通过调控靶基因来参与组织细胞的生长发育。与血液相比，在唇腭组织上提取的miRNA具有更高的质量。有学者腭裂手术时从硬腭中获得约3mm的腭黏膜，对照组则是在扁桃体切除术距硬腭正中约1cm处获得。培养、扩增腭组织成纤维细胞，并通过测序分析及RT-qPCR验证显示，3个miRNAs（hsamiR-93-5p、hsa-miR-18a-5p和hsa-miR92a-3p）出现过表达，而6个miRNAs（hsa-miR-29c-5p、hsa-miR-549a、hsa-miR-3182、hsamiR-181a5p、hsa-miR-451a和hsa-miR-92b-5p）则表达下调，但是作者认为仍需要大量的基因组和表达研究来验证这些发现。
此外，另有研究探讨了候选miRNAs在人唇成纤维细胞增殖和靶基因调控实验中的功能意义，发现miR-497-5p和miR-655-3p对这些细胞的增殖有明显的抑制作用，并且显著下调了所预测的唇腭裂相关基因的表达。可见miRNA-655-3p和miRNA-497-5p可以通过调控人唇裂相关基因来抑制人唇细胞的增殖。同样，国内学者在患儿唇腭组织与正常新生儿脐带组织的miRNA表达进行芯片杂交研究，结果发现有254条miRNA出现明显表达差异，其中的hsa-miR-3611与hsa-miR-764所对应的靶基因GABRB3和F13A1在以往文献中报道与唇腭裂具有相关性。
3.2.4其他
除了以上研究的组织源，还有学者从唇腭裂患者的唾液中分离提取了miRNA，发现其中表达差异较明显的miR-141、miR-324-3p和miR-223在调节MTHFR、SATB2、PVRL1等CLP相关基因。另一方面，这些miRNA是有效的预后生物标志物，而且采集唾液样本是一种非侵入性的程序，能被CLP患者及家属接受。唇腭裂的发生机制十分复杂，涉及的miRNA及其靶基因更是众多，但目前大多数唇腭裂的miRNA研究还只触及到靶基因的相关功能及信号通路的富集分析，其具体调控机制尚未完全明确。
4.总结与展望
近年来，miRNA研究受到了极大关注，其对于组织器官发育及疾病发生转归都有着特异性的影响。现有研究表明，miRNA的调控机制繁杂，通过与其靶基因的结合，参与多个信号通路的传导，调节多种细胞的迁移、分化，在颌面部发育及胚胎发育中的作用不可替代。虽然miRNA是研究的热点，且已有少数被证实在唇腭裂中的调控作用，但其中更多的机制尚未可知。随着研究方法与技术的进步，未来对miRNA特异性的探讨将逐渐深入，有利于研究其调控机制，同时作为生物分子标记物为唇腭裂的早期疾病筛查、诊断及防治提供新的途径。
