miRNA在唇腭裂中的研究进展

2021-3-26 15:03  来源:临床口腔医学杂志
作者:唐璟 宋庆高 阅读量:1765

    先天性唇腭裂是最常见的颌面部发育畸形,全球新生儿患病率约为1∶600~1∶700。临床上约70%为非综合征型唇腭裂(non-syndromic cleft lip with/without palate,NSCL/P),其具体形成原因尚未完全明了,先天缺陷背后的作用机制尚不完全清楚,目前认为是复杂的多基因遗传因素和环境因素共同作用的结果。尤其是在胎儿发育成形的前12周,不管是基因的突变还是外界环境的干扰,最容易导致唇腭裂的发生。

    随着基因检测技术的进步及实验研究的深入,已有多个与唇腭裂相关的易感基因位点被研究证实,如干扰素调节因子6(interferon regulatory factor 6,IRF6)、肌节同源盒基因同系物1/2(muscle segment homeobox 1/2,MSX1/2)、成纤维细胞生长因子受体2(fibroblast growth factor receptor2,FGFR2)等。

    最近,越来越多的证据表明非编码RNA在生物发育过程中扮演的角色远比以前设想的重要,miRNA被认为是人类腭裂基因的潜在修饰因子,可作为研究腭裂病因机制的一种新手段,是近年来尤为关注的热点。miRNA的基因调控广泛作用于生物发育及疾病发生,具有重要的生物学意义。有研究发现,在动物基因组中,miRNA约调控三分之一的基因,且参与到唇腭部发育的基因信号表达。本文将对miRNA在唇腭裂中的研究进展进行一综述。

    1.miRNA的形成与调控机制

    miRNA是一种长度大约22个核苷酸(nt)组成的内源性非编码RNA,通过以DNA为模板转录加工形成。成熟miRNA的形成过程如下:首先通过RNA聚合酶的作用,miRNA所对应的基因被转录为初级miRNA(pri-miRNA,primarymiRNA),然后初级miRNA在内切酶的作用下被剪切成带有茎-环结构的前体miRNA(pre-miRNA),上述过程是在细胞核内进行。随后前体miRNA被转运蛋白运送到细胞质中,经过酶的作用加工为成熟的双链复合体,最后其中的一条miRNA链与AGO蛋白结合形成沉默复合体,另一条miRNA链则引导RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)到达其靶基因,调控其表达。

    通常情况下,miRNA的5’端2-8核苷酸位点与其靶基因mRNA的3’非编码区(untranslated region,UTR)完全结合,而其余位点不完全配对,若miRNA与mRNA完全互补匹配,则会导致mRNA降解;若匹配程度较低,则会抑制mRNA的翻译。在真核生物中,每个miRNA可与上百个靶基因相结合,同一mRNA可接受多个miRNA的调控。此外,miRNA还具有时空特异性及微调性,调控近30%的基因,在细胞增殖、凋亡、生长发育及肿瘤等生理、病理活动中至关重要。由此可见,miRNA在基因调控表达上发挥着重要作用。

    2.miRNA的生物功能

    miRNA的功能繁杂多变,广泛参与到各种信号分子通路中,形成复杂的调控网络,其与生物的生长发育密切相关,从调节生命生理活动到疾病发生转归,都扮演着重要角色。在胚胎的各个发育系统中,例如miRNA在神经系统的构建、神经元细胞的发育,都具有较强的神经活性;同时,miRNA也对多种免疫细胞的分化、增殖及发育进行调节。研究表明,在T细胞不同的发育阶段miRNA有着不同的表达变化。

    研究证实miRNA在血液、唾液等多种生物体液中可以无细胞稳定的存在,miRNA表达水平的变化提示可能与人类疾病的发生相关,其作为一种新的分子标记物具有强大的潜在效应。近年来,研究者们对miRNA的探索主要集中于肿瘤癌症等疾病领域。罗彬瑞等发现在喉鳞状细胞癌患者的唾液中,检测到miRNA-205过表达,认为其可作为喉癌的早期诊断,从而避免有创检查;此外,谢子钧等通过提取唾液miRNA应用于食管癌的早期筛查,证明是具有诊断价值的生物分子标记物。因此在miRNA与肿瘤的相关研究可以预见,其对未来肿瘤疾病的诊疗和药物使用都有重大帮助。

    目前,先天性发育畸形的患病率仍然很高,但miRNA在胚胎发育方面的报道却较少。研究表明,miRNA对颅面发育有重要的调节作用,异常的基因表达会导致到达额窦区域并形成面部骨骼的神经嵴细胞(neural crest cells,NCCs)数量减少,或导致NCC模式的失败以及向骨骼和软骨的分化,比如从斑马鱼的咽弓、耳囊和躯干肌肉的miR-23b和miR-133b表达分析可见,其表达上调可导致脏器软骨结构异常和明显的面中部裂。显然,miRNA在先天发育畸形领域可待更深的挖掘。

    3.miRNA与唇腭的发育

    3.1miRNA与唇腭发育的相关信号通路关系

    3.1.1与Wnt信号通路之间的关系

    目前研究证明,Wnt信号通路是参与胚胎发育的重要信号途径之一,其基因的突变与唇腭裂的发生有着显著关系。同时,miRNA与Wnt基因家族的关联同样密切,有研究报道,显著表达差异的has-miR-1260b,hsa-miR-205-5p,has-miR-24-3p等均与Wnt家族的Wnt5a、Wnt9b、Wnt10a等信号分子靶向结合,而Wnt5a、Wnt9b等基因已被证实可诱导细胞定向迁移、分化,参与调控唇腭部的发育过程。

    此外,陈勇龙等研究发现在小鼠胚胎腭间充质细胞(embryopalatal mesenchymal cell,EPMC)的miR-382表达上调后,下游Wnt信号通路的Wnt1、Wnt3等基因出现明显下调,认为miR-382通过调控其靶基因Porcn的下调来作用于Wnt基因的表达,从而影响EPMC的迁移、分化,导致腭板融合失败。

    3.1.2与转化生长因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)通路的关系

    上皮-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)是腭板融合的重要过程,也是腭形成过程中的关键步骤。研究证实,TGF-β通路可广泛参与腭板的融合过程,其调控的关键因子Smad2和Snail在EMT过程中更是发挥着重要作用,然而在腭部miR-200b过表达后,Smad2和Snail出现表达下调,其介导的EMT作用大幅度减弱,从而导致腭板融合失败。另外,miR-200b还可与ZEB(zinc finger E-box binding protein)因子结合,其表达下调可使ZEB因子促进EMT作用。

    Zhang等探讨了miR-106a-5p通过TGF-β/Smad信号通路调节腭裂细胞凋亡和代谢组学变化发现,miR-106a-5p在腭裂组织中的表达增加,与Tgfbr2蛋白水平呈负相关。荧光素酶活性测定进一步证明Tgfbr2是miR-106a-5p的直接靶标,认为miR-106a-5p增加PMC的凋亡水平,可能与其抑制TGF-β信号通路有关。

    3.1.3与BMP(bone morphogenetic protein)信号通路的关系

    BMP信号通路与唇腭裂的发生密切相关,而且BMP是TGF-β超家族系的成员,其同样作用于下游Smad蛋白,影响EMT过程。研究发现,BMP突变可导致小鼠口面裂的形成,而miR-17-92靶向结合于Smad1/5/8,在其表达上调后调节腭胚间质细胞分化,可促进小鼠口面畸形的发育。可见,BMP信号通路可与miR-17-92相结合,调控其表达,从而参与颌面部的发育。此外,据报道,miR-17-92与E2F家族基因最重要的功能是调节细胞周期和促进细胞增殖,而PMC的正常细胞周期进程和增殖对腭部发育具有重要意义。E2F成员E2F1过表达可以显著增加miR-17-92成员的表达,E2F1和miR-17-92之间存在的负反馈环可能通过调节PMC的增殖和周期参与腭部发育。

    3.1.4与SHH(Sonic Hedgehog)信号通路的关系

    Shh信号分子作为EMT作用的重要调控因子,受到研究者们的广泛关注。其对胚胎期面突的细胞分化增殖、上皮间充质的转化起到举足轻重的作用。可见Shh的异常表达易导致畸形的发生。在一项对斑马鱼的实验发现,由于Shh信号的接收发生在初级纤毛处,而初级纤毛是传递多种信号分子的细胞感受器,当miR-219功能降低时,会加速初级纤毛的生长,同时升高Shh信号,促进细胞信息交流,调节生理活动。此外,另有研究报道,在对斑马鱼口腔外胚层中的miRNA-140过表达后,会明显抑制信号分子Shha的表达,可见miRNA-140能够通过调节信号分子从而影响到Shh信号通路的传导。

    3.1.5与Hippo信号通路的关系

    Hippo信号通路同样是胚胎生长发育的重要传导途径之一,对细胞的分化、增殖、凋亡都发挥着重要作用,与唇腭裂的发生具有相关性。但目前对于miRNA与Hippo在唇腭裂领域的相关研究涉及较少。有研究发现,在妊娠第14.5天的小鼠胚胎腭裂模型mRNA-Seq实验中,通过GO和KEGG对差异表达的基因进行功能注释分析、qPCR检测用于验证RNAseq数据,结果表明,淋巴样增强因子1(lymphoid enhancement factor 1,LEF1)和Smad家族成员3(Smad3)显著富集了EMT相关的生物学过程,而且其表达下调通过Hippo信号通路抑制EMT作用,导致腭裂的形成。miRNA与Hippo信号通路之间可能同样具有很深的渊源,但尚需要实验验证。

    3.1.6其他

    在成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)信号通路中,FGF可以与其受体FGFR特异性结合,进行细胞信息传递,作用于EMT。miRNA-1246、miRNA-93和miRNA-1323在腭裂中出现表达上调,而三者又可调控FGFR2的表达量使其下调,进而影响腭板的融合。此外,在斑马鱼中的miRNA-140可调节血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)介导的神经嵴细胞对口腔外胚层的迁移分化,若其过表达则负调控Pdgf信号,形成腭裂,但是若miRNA-140的功能抑制则会导致腭部形状改变,形成畸形。

    不同的信号通路之间并不是独立的,而是相互影响、相互作用,共同参与调节细胞的生理活动。唇腭部组织的生长发育过程复杂严谨,涉及到各种信号通路,形成了庞杂的网络调控系统,因此对调控基因信号的任何微小干扰都可能会造成严重的后果。

    3.2唇腭裂患者的miRNA差异表达

    3.2.1外周血浆miRNA差异表达

    血浆miRNA是近年来出现的一类影响多种生物功能的新型调节分子。研究发现,从外周血提取的血浆miRNA在唇腭裂患者与正常人的对比中有明显的表达差异。在探讨人类非综合征性口面裂(non-syndromic orofacial clefts,NSOC)相关的血浆miRNA实验中,唇裂(cleft lip only,CLO)、腭裂(cleft palate only,CPO)及唇腭裂(cleft lip with palate,CLP)有着重叠又不同的失调miRNA表达谱,提示不同的唇腭裂类型可能有不同的调节机制。通过人类miRNA微阵列数据分析发现,三者共同上调的miRNA有57条,下调的有45条,显著变化的有miR16-2-3p,miR-215-5p,miR-365a-3p,miR-574-5p,miR-584-5p和miR-877-5p等,其共同的关键基因靶点反映了Wnt、Notch、TGF-β和Hedgehog(Hh)信号通路的功能关系,参与多种细胞的分化增殖。

    3.2.2血浆外泌体miRNA差异表达

    外泌体是一种大多数细胞可分泌的内源性小囊泡,广泛存在于各种生物液中,其包含的核酸具有重要的生物学价值,包括与疾病发生密切相关的miRNA。研究表明,有学者通过miRNA测序筛选出NSCL/P血浆外泌体中表达异常的miRNA,并进行生物信息分析,发现miRNA表达上调的有14条,下调的有4条。其中具有代表性的是miRNA-133a-3p、miR-150、miR-128,而miRNA-133a-3p为Wnt信号通路重要的调节因子,其高表达可能抑制了Wnt的相关基因,导致细胞无法定向迁移、分化。

    此外,该学者还在血浆miRNA和血浆外泌体miRNA的差异对比中发现,血浆外泌体中表达上调的miRNA有13个,下调的有3个,而血浆中表达上调的miRNA有170个,下调的有62个。导致这种表达差异原因分析,目前认为是包含在外泌体中的miRNA受外界环境的干扰小,显得纯度及富集程度更高,可以更全面的反映表达情况。

    3.2.3唇腭组织与脐带组织miRNA差异表达

    miRNA主要通过调控靶基因来参与组织细胞的生长发育。与血液相比,在唇腭组织上提取的miRNA具有更高的质量。有学者腭裂手术时从硬腭中获得约3mm的腭黏膜,对照组则是在扁桃体切除术距硬腭正中约1cm处获得。培养、扩增腭组织成纤维细胞,并通过测序分析及RT-qPCR验证显示,3个miRNAs(hsamiR-93-5p、hsa-miR-18a-5p和hsa-miR92a-3p)出现过表达,而6个miRNAs(hsa-miR-29c-5p、hsa-miR-549a、hsa-miR-3182、hsamiR-181a5p、hsa-miR-451a和hsa-miR-92b-5p)则表达下调,但是作者认为仍需要大量的基因组和表达研究来验证这些发现。

    此外,另有研究探讨了候选miRNAs在人唇成纤维细胞增殖和靶基因调控实验中的功能意义,发现miR-497-5p和miR-655-3p对这些细胞的增殖有明显的抑制作用,并且显著下调了所预测的唇腭裂相关基因的表达。可见miRNA-655-3p和miRNA-497-5p可以通过调控人唇裂相关基因来抑制人唇细胞的增殖。同样,国内学者在患儿唇腭组织与正常新生儿脐带组织的miRNA表达进行芯片杂交研究,结果发现有254条miRNA出现明显表达差异,其中的hsa-miR-3611与hsa-miR-764所对应的靶基因GABRB3和F13A1在以往文献中报道与唇腭裂具有相关性。

    3.2.4其他

    除了以上研究的组织源,还有学者从唇腭裂患者的唾液中分离提取了miRNA,发现其中表达差异较明显的miR-141、miR-324-3p和miR-223在调节MTHFR、SATB2、PVRL1等CLP相关基因。另一方面,这些miRNA是有效的预后生物标志物,而且采集唾液样本是一种非侵入性的程序,能被CLP患者及家属接受。唇腭裂的发生机制十分复杂,涉及的miRNA及其靶基因更是众多,但目前大多数唇腭裂的miRNA研究还只触及到靶基因的相关功能及信号通路的富集分析,其具体调控机制尚未完全明确。

    4.总结与展望

    近年来,miRNA研究受到了极大关注,其对于组织器官发育及疾病发生转归都有着特异性的影响。现有研究表明,miRNA的调控机制繁杂,通过与其靶基因的结合,参与多个信号通路的传导,调节多种细胞的迁移、分化,在颌面部发育及胚胎发育中的作用不可替代。虽然miRNA是研究的热点,且已有少数被证实在唇腭裂中的调控作用,但其中更多的机制尚未可知。随着研究方法与技术的进步,未来对miRNA特异性的探讨将逐渐深入,有利于研究其调控机制,同时作为生物分子标记物为唇腭裂的早期疾病筛查、诊断及防治提供新的途径。

编辑: 陆美凤

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