细胞外囊泡是一种膜结合载体，可分为外泌体、微囊泡和凋亡小体3种类型。外泌体的直径通常为30~150nm，密度为1.13~1.19g/mL。外泌体作为细胞外囊泡的一种重要类型，在近十年来受到学者们的广泛关注。外泌体可由多种细胞分泌，并通过其内容物（包括脂质、核酸和蛋白质）介导细胞间通信，发挥重要的生理和病理作用。在人体中，成骨细胞介导的骨形成及破骨细胞介导的骨吸收，是一个不断发生发展的动态过程，并通过复杂的信号通路维持平衡，骨改建过程贯穿于人的一生。正畸治疗正是利用这个动态平衡，达到纠正错畸形的目的。
在正畸牙移动的过程中，多种细胞类型参与牙槽骨稳态，如骨髓间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、牙周膜干细胞和免疫细胞等。而不同细胞来源的外泌体，穿梭在各种类型的细胞中，充当信使，介导细胞间通信。该过程与全身其他骨组织的改建基本相似，但因牙齿这一特殊器官的参与，其又具有特异性。本文先以骨源性外泌体与骨稳态为中心，整体概述全身骨组织改建的相似性；再以正畸牙移动相关的外泌体为切入点，就局部牙槽骨改建时所具备的特异性做一阐述。
1.骨源性外泌体的特征及在骨改建中的功能
外泌体可由多种细胞产生，在分泌到细胞外微环境时可能携带多种物质，如蛋白质、核酸及脂质等，递送的内容物与母细胞的生物特征密切相关。外泌体作为信使从母细胞穿梭到靶细胞，介导细胞间通信。与骨相关的外泌体也含有其特殊的典型成分，观察外泌体的内容物，可以更好地了解骨改建的过程。
1.1间充质干细胞来源外泌体
骨髓间充质干细胞来源外泌体中，含有与成骨分化相关的微小RNA（miRNAs）和细胞因子。间充质干细胞来源外泌体表达CD13、CD29、CD44、CD73和CD105等特征标志物。由间充质干细胞衍生的成骨细胞前体细胞（MC3T3细胞系）分泌的外泌体中分离出1069个蛋白，其中786个蛋白存在于ExoCarta数据库中。
在分化的人骨髓源性间充质干细胞来源外泌体中，有7个信使RNA（mRNAs）：ACIN1、DDX6、DGKA、DKK2、Lsm2、RPS2和Xsox17，随时间的推移表现出显著的差异表达。此外，整合素-金属蛋白酶17（ADAM17）和核因子-κB（NF-κB）在成骨分化的间充质干细胞来源外泌体中也异常表达。Santos等已证明，骨髓间充质干细胞通过旁分泌途径在成骨细胞分化中发挥重要作用。Qin等将pkh67标记的骨髓间充质干细胞来源外泌体与人成骨细胞共培养，发现标记物分布在成骨细胞的内质网、高尔基体和溶酶体等细胞器中。这一发现表明，骨髓间充质干细胞来源外泌体可被成骨细胞吞噬，并将内容物释放到靶细胞中。
此外，骨髓间充质干细胞来源外泌体递送到颅缺损模型中时，外泌体明显促进骨再生及重建。Xu等研究了骨髓间充质干细胞成骨分化过程中分泌外泌体的miRNAs，研究发现，let-7a、miR-199b、miR-218、miR-148a、miR-135b、miR-203、miR-219、miR-299-5p和miR-302b显著上调，而miR-221、miR-155、miR-885-5p、miR-181a和miR-320c显著下调。最近的研究表明，骨髓间充质干细胞来源外泌体的miR-22-3p可抑制MYC/PI3K/AKT信号通路，从而抑制成骨分化。骨髓间充质干细胞来源外泌体也可以通过直接调节成骨细胞增殖和活性参与骨改建。间充质干细胞来源外泌体可上调骨形成蛋白9（BMP9）和转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达，有效诱导成骨细胞的成骨分化。
1.2成骨细胞来源外泌体
成骨细胞来源于具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞，通过分泌糖蛋白和胶原蛋白，在骨基质的合成、分泌和矿化中发挥重要作用。成熟的成骨细胞来源外泌体可以诱导自身分化和矿化，形成正反馈来参与骨改建过程。成骨细胞来源外泌体含有蛋白（黏附蛋白、胶原蛋白、TRIP-1等）、miRNAs（miR-1192、miR-680等）和mRNAs（AGAP2、ZNF677等）。Cui等进行体外研究证实，矿化成骨细胞与骨髓间充质干细胞之间存在正反馈机制。实验结果表明，矿化成骨细胞来源外泌体被骨髓间充质干细胞内吞，显著促进其成骨分化；在此过程中，成骨细胞来源外泌体的促成骨功能依赖于Wnt信号通路的激活，机制是通过下调Axin1和上调β-catenin的表达实现的；且外泌体中可检测到miR-30d-5p、miR-133b-3p、miR-140-3p、miR-335-3p、miR-378b和miR-677-3p的高表达。
成骨细胞来源外泌体不但可以诱导自身向骨细胞分化、促进成骨，还可以通过旁分泌机制诱导破骨细胞分化，从而协调骨重建过程。Deng等发现，从成骨细胞释放的NF-κB受体活化因子配体（RANKL）高表达外泌体可以转移到破骨细胞前体细胞，促进其分化。Solberg等研究表明，成骨细胞来源的溶酶体膜蛋白1（LAMP1）阳性外泌体中，携带RANKL、骨保护蛋白（OPG）和TRAP酶，这些物质可以显著诱导破骨细胞的分化。
1.3破骨细胞来源外泌体
破骨细胞来源外泌体的特征性蛋白有CD63、EpCAM、TSG101、HSP70、β-actin、RANK、Sema4D、ephrinA2、laminA/C等。Huynh等成功分离了破骨细胞来源外泌体，检测到富含RANK的外泌体，可以抑制鼠骨髓中依赖1，25-二羟维生素D3型的破骨细胞形成，证明破骨细胞来源外泌体是破骨细胞发生的旁分泌调节因子。在Li等的研究中，提出了破骨细胞来源外泌体中的miR-214，可以介导破骨细胞与成骨细胞的细胞间通信，参与局部骨稳态。
Sun等也提出miR-214通过破骨细胞来源外泌体参与调控成骨细胞，此外还发现ephrinA2是破骨细胞来源外泌体上的一种表面蛋白，可以与成骨细胞表面受体EphA2相互作用而靶向成骨细胞。与来自破骨细胞的外泌体不同，来自破骨细胞前体的外泌体可以刺激破骨细胞的形成。外泌体可能代表一种途径，通过外泌体，骨细胞可以感知破骨细胞和破骨细胞前体的存在，并根据这些信息对嗜钙信号做出适当的反应。
综上，来自破骨细胞前体的外泌体刺激破骨细胞的增殖，而来自成熟破骨细胞的外泌体抑制了破骨细胞的形成。
1.4骨细胞来源外泌体
骨组织主要由骨基质和骨细胞组成。骨基质通过骨陷窝-骨小管系统紧密相连。骨细胞是成熟骨组织中数量最多的细胞，为成骨细胞谱系的终末分化细胞，广泛分布于骨基质中。骨细胞具有识别骨损伤和机械应力并启动骨改建的功能。Sato等首次指出骨细胞来源外泌体与血浆循环外泌体的关系：与正常小鼠血浆相比，骨细胞减少的小鼠血浆循环外泌体中，miR-3473a、miR-3473b、miR-3473e、miR-5128、miR-6244、miR-6239、miR-5132-5p、miR-705、miR-208a-5p、miR-3104-5p、miR-1224-5p和miR-5621-5p共12个miRNAs表达水平显著降低，这很可能是由于骨细胞来源外泌体减少所致。
骨细胞释放出含有特定miRNAs的外泌体，参与血液循环，在其他器官或组织中发挥作用，以调节生物活动。Qin等研究显示，肌肉生长抑制素可直接影响骨细胞功能，抑制成骨细胞分化，机制是通过抑制骨细胞来源外泌体中的miR-218来实现的，其揭示了miR-218在治疗骨相关疾病时的可能性。
2.外泌体在正畸牙移动中的作用
2.1骨组织、牙周组织在正畸牙移动过程中对机械应力的感应及传导
施加在牙齿上的正畸力和作用时间，能刺激周围组织的神经递质、细胞因子、生长因子及各种免疫细胞集落因子的合成及和释放。在学者普遍接受的经典“压力-张力理论”中，骨组织及牙周组织感知机械应力的变化。在压力侧，牙周膜因压力导致血运供给不足，牙周膜细胞启动凋亡程序，透明化的胶原纤维和基质降解，进一步被巨噬细胞吞噬，透明化组织旁破骨细胞分化加速骨吸收。
正畸牙移动是在这些进程完成之后开始出现的。骨吸收过程中，由于破骨细胞的参与，会在骨组织中形成不规则的空洞，之后由于成骨细胞的作用，这些空洞将被新形成的骨填充。在张力侧，牙周膜、牙槽骨和牙骨质分别启动改建程序。间充质干细胞向成骨细胞分化，成熟的成骨细胞形成类骨质或Ⅰ型胶原，进而矿化形成新骨。研究证实，内皮一氧化氮合酶及前列腺素介导张力侧的骨形成。正畸治疗正是利用体内骨改建的动态平衡，纠正错畸形。
2.2外泌体参与正畸牙移动过程中骨改建的应用展望
正畸牙移动过程中的骨改建，与全身其他部位的骨改建既相似又存在其特异性，这种特异性主要体现在牙周组织的变化上。牙周膜干细胞，作为牙周膜上的种子细胞，通过旁分泌功能在牙周组织改建中的作用倍受关注。研究表明，牙周膜干细胞来源外泌体表面表达CD9、CD63、CD81和TSG101，能加速修复大鼠的牙周组织缺损，促进周围细胞的成骨分化。
Pizzicannella等证实，来源于人牙周膜干细胞的外泌体，促进骨再生的机制是通过上调成骨相关因子RUNX2、COL1A1、BMP2/4，以及上调血管生成的相关因子VEGFA和VEGFR2来实现的。牙周膜干细胞的相关研究还显示，其来源外泌体对靶细胞具有诱导成骨分化的能力，其诱导成骨分化的能力差异与基因KAT6A相关。外泌体相对稳定，可长期冷冻保存。与药物不同，外泌体原则上可在不同水平精确调控靶细胞。
研究表明，静脉注射的外泌体有归巢效应，来源于破骨细胞和成骨细胞的外泌体可能有优先定位于骨组织的能力，其中包括牙槽骨。这一观点得到了Li等的研究支持。从患者体内提取细胞培养后得到的外泌体，可能对正畸治疗提供直接帮助。例如：可以从正畸患者的静脉血中获得外周单核细胞，在体外刺激分化为破骨细胞，在整个培养过程中收集不同阶段的外泌体；来自破骨细胞前体的外泌体刺激破骨细胞的形成，而来自破骨细胞的外泌体刺激成骨分化；这些外泌体可能会增加正畸牙移动的速率，以及促进正畸牙移动后的骨改建，这为临床医生提供了新的思路。而且，已有证据证实，间充质干细胞来源外泌体可以提高骨愈合速度和疗效。此外，机械力诱导的骨细胞来源外泌体通过miR-181b-5p/PTEN/AKT信号通路，可以促进人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化。
3.小结
自Angle时代以来，正畸学从经验主义到循证医学的发展日新月异。正畸学开始通过细胞和生化信号的视角，不断丰富理论基础，并更新和完善临床应用。目前，外泌体在正畸学中的作用只揭开了冰山一角，未来外泌体的研究可能对正畸治疗和创新应用具有深远的临床意义。
