牙周炎症微环境对牙龈上皮屏障影响研究进展

    牙周炎是由菌斑微生物引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病，菌斑微生物会刺激导致局部炎症反应并激活天然免疫系统。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）被认为是牙周炎发病机制中的关键病原体。牙龈上皮是抵御病原微生物入侵牙周组织的第一道屏障。
    牙龈上皮下有一个复杂的免疫网络，包括巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞等免疫细胞。当牙周组织发生炎症时，活化的巨噬细胞（通常为M1型）能够分泌多种细胞因子参与炎症反应，如白细胞介素（interleukin，IL）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等。
    细胞因子在牙周组织炎症反应中起着重要作用，上皮与先天和适应性免疫细胞之间的沟通对于快速识别和有效清除上皮表面的病原体至关重要。口腔上皮细胞会对微生物攻击免疫细胞后产生的细胞因子、趋化因子和抗微生物肽等可溶性介质做出相应免疫反应。
    1.牙周炎症微环境的主要构成
    口腔细菌和牙周感染被认为是几种系统性疾病的潜在危险因素，高度复杂的牙周微生物群不仅与牙周健康的建立密切相关，同时也在牙周病的发展中起主要作用，该微生物群主要包括细菌、炎症细胞及炎症细胞分泌的炎性介质等。当人牙龈上皮细胞（human gingival epithelial cells，HGECs）感知到微环境的变化时，会表现出多种不同的细胞行为（cells behave），细胞行为由它们与细菌、免疫细胞及其趋化因子的协同相互作用来指导。微环境的调控影响HGECs的行为，通过与微环境的相互作用，主动和（或）被动地决定HGECs的命运，如增殖、迁移、分化和凋亡等。
    2.牙周炎症微环境对牙龈上皮屏障的破坏
    2.1TNF-α
    当巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞受到微生物成分的刺激时，炎症细胞因子（如IL-1和TNF-α）的分泌增加。上皮的物理屏障功能主要依赖于紧密连接和黏着连接。TNF-α在上皮屏障形态的破坏中起着关键作用，过度分泌可能会导致上皮紧密连接的完整性受损，促进牙周致病菌的侵袭。He等研究表明，TNF-α可诱导肠上皮细胞紧密连接的断裂，并引起肠上皮屏障的破坏。TNF-α引起的屏障功能障碍可归因于多种因素，总结如下。
    2.1.1TNF-α通过激活NF-κB通路破坏上皮屏障
    TNF-α调节巨噬细胞的多种炎症信号通路，包括NF-κB通路。研究人员用U937-3xκB-Luc细胞株证明TNF-α激活了NF-κB信号通路，而NF-κB信号通路是促炎反应的关键驱动因子；有证据表明TNF-α可能通过放大炎症过程和破坏角质形成细胞的屏障来促进牙周组织破坏。
    2.1.2TNF-α通过下调钙黏素（e-cadherin，E-cad）破坏上皮屏障
    E-cad是桥粒标志物，其正确表达对维持上皮的完整性至关重要。因此，E-cad可能在牙龈上皮的连接中发挥重要的抗细菌侵袭作用。Arun等发现，E-cad在牙龈炎和牙周炎的牙龈上皮中的表达减少。Regmi等研究表明，炎症介质可降低上皮细胞中E-cad的表达；此外据Fujita等报道，一些炎症介质如TNF-α和活性氧（Ros）降低了上皮细胞E-cad的表达。因此，我们认为TNF-α导致了HGECs中E-cad的表达下降，进而破坏了上皮屏障。
    2.2IL-31通过下调紧密连接蛋白claudin-1破坏上皮屏障
    IL-31是IL-6细胞因子家族的一员，在包括肥大细胞、巨噬细胞等免疫细胞中表达。IL-31在黏膜组织和皮肤的天然免疫中起重要作用，在如特应性皮炎、变应性哮喘、系统性红斑狼疮、炎症性肠病和慢性牙周炎等慢性炎症疾病中的表达均有增加。Tada等的研究表明，P.gingivalis诱导肥大细胞产生IL-31，其依赖于赖氨酸特异性半胱氨酸牙龈蛋白酶K（gingipainK，KGP）的活性，从而导致牙龈上皮屏障功能障碍。
    claudins是紧密连接相关的四肽蛋白，在调节紧密连接的上皮屏障中起着重要的作用，而claudin-1表达的降低与牙周病的发生有关。Wilcz-Villega等研究显示，HGECs被感染后，其表面claudin-1的表达会迅速下降。因此，我们认为肥大细胞对claudin-1的下调是由肥大细胞产生的IL-31引起的，进而引起牙龈上皮屏障功能障碍，导致牙周慢性炎症发生。
    3.牙周炎症微环境影响HGECs凋亡
    细胞凋亡被认为是一种参与和感染性及炎症性疾病相关的广泛组织破坏的潜在机制，如与幽门螺杆菌相关的胃溃疡、动脉粥样硬化和慢性牙周炎等。HGECs凋亡触发上皮屏障功能的破坏，对牙周炎的发生和发展都有很大影响。
    3.1TNF-α通过上调miR-142促进凋亡
    已有Miyagawa等研究证明，TNF-α可增加HGECs的通透性，增加牙周病原体的侵袭能力。TNF-α还能对HGECs直接产生破坏作用，如触发其凋亡。微小RNA（microRNA，miRNA）是一种内源性的、小型非编码RNA，参与细胞凋亡、细胞通信、炎症反应、血管新生和肿瘤生长等过程，在免疫抗原呈递、肿瘤生长与迁移、临床疾病诊断等过程中也都发挥重要作用。
    许多miRNA在牙周炎患者的正常牙龈组织和炎症牙龈组织中有不同程度的表达。已确定，相对于健康的牙龈组织，miR-142在发炎的牙龈组织中表达上调。Li等研究表明，慢性牙周炎患者血清中miR-142与TNF-α的表达水平呈正相关，miR-142过表达可显著诱导HGECs凋亡，而抑制miR-142能明显阻断TNF-α诱导的HGECs凋亡，因此认为miR-142介导TNF-α诱导的HGECs凋亡反应，miR-142可能参与了TNF-α相关牙周炎的发病过程。
    3.2IL-1β通过激活caspase通路促进凋亡
    IL-1β是一种强有力的炎症细胞因子，是先天免疫反应的重要组成部分，参与许多重要的细胞功能，如增殖、活化和分化。Lv等报道称，TNF-α和IL-1β通过上调趋化因子、增加屏障通透性和下调HGECs的紧密和黏着连接分子的表达来增强白细胞黏附。IL-1β的产生至少受到两个步骤的调控，第一步在转录水平通过Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）调节，第二步在转录后水平由炎症分子（一种激活caspase-1的蛋白复合物）调节，进而诱导HGECs凋亡。
    3.3IL-8通过下调caspase-3抑制凋亡
    IL-8通常由多种细胞释放，如中性粒细胞、巨噬细胞等。IL-8的产生对调节生物体的炎症反应起着重要作用。研究显示，HGECs暴露于放线菌（A.actinomycetemcomitans）导致裂解的caspase-3增加，进而诱导HGECs凋亡。而经IL-8预处理，能抑制放线菌诱导caspase-3增加的现象。表明IL-8能下调caspase-3，抑制HGECs的凋亡。
    4.牙周炎症微环境对HGECs增殖和迁移的影响
    4.1IL-8通过诱导HGECs的DNA合成而促进增殖和迁移
    Scott等认为，IL-8介导的中性粒细胞的趋化和活化作用都在很大程度上调节了牙周组织的破坏。IL-8除具有白细胞趋化活性外，还可通过其受体作用于上皮细胞，促进其迁移、增殖。IL-8能诱导HGECs的DNA合成增加，进而促进HGECs增殖。同时，IL-8在激活HGECs在牙龈上皮中的迁移和龈袋的形成都起着重要的作用，由于牙周袋是一种位于牙龈上皮和牙骨质之间的受损组织，且未被上皮组织覆盖，因此需要再上皮化来封闭牙周缺损，而HGECs增殖和迁移与牙龈上皮的再上皮化有关。因此，HGECs的迁移是保护牙周组织免受各种感染的必要条件。总之，IL-8可能通过促进HGECs的增殖和迁移及防止其凋亡而促进牙龈上皮向下生长。
    4.2低浓度中性粒细胞防御素促进HGECs增殖和迁移
    牙周病组织中α-防御素浓度的增加可能会影响HGECs的生物学行为。由于HGECs分泌细胞外基质蛋白及其受体，α-防御素可与其结合，因此，α-防御素能促进创口愈合和细胞迁移，低浓度的α-防御素能促进HGECs增殖、迁移和牙周组织创口愈合。
    虽然中性粒细胞在宿主防御中起着重要作用，但它的过度表达对宿主组织来说是致命的。随着α-防御素浓度的增加，会破坏HGECs与硬组织表面的结合，促进细菌对HGECs的黏附，使牙周组织愈合受损，机会性细菌的毒力增加。
    5.牙周炎症微环境对牙龈上皮免疫反应的影响
    5.1IL-17通过上调趋化因子CXCL8刺激牙龈上皮产生免疫反应
    Medara等研究显示，与健康对照牙周组织相比，牙周炎组织中IL-17的表达增加。T细胞与HGECs通过与IL-17的相互作用在牙周病的发病过程中起着重要的作用。一旦发生牙周组织病变，IL-17主要通过增强趋化因子CXCL8的产生来刺激HGECs在牙周炎中产生天然免疫反应。
    5.2IL-36通过激活IRAK1和NF-κB通路刺激牙龈上皮产生免疫反应
    IL-36家族细胞因子（IL-36α、IL-36β和IL-36γ）是IL-1家族的成员，可能在免疫应答中起关键作用。IL-36γ可刺激人树突状细胞和巨噬细胞产生趋化因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等。IL-36γ可通过IRAK1和NF-κB信号通路刺激牙龈上皮的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）的分泌和表达。
    其中MMP9参与了免疫细胞的招募并调节免疫细胞的功能。而NGAL则在介导宿主防御感染方面具有多方面的作用。因此，我们认为IL-36是宿主防御口腔病原体的重要调节因子，以维持牙周组织的稳态。
    6.结语
    牙龈上皮是防止微生物成分进入深层结缔组织的天然物理屏障，同时也在牙周炎症组织的非特异性免疫中起重要作用。近年来人们发现，P.gingivalis不仅可直接侵入牙龈上皮，还可持续作用于牙周内的免疫细胞，形成炎症微环境，而HGECs在此环境中会发生一系列反应，如增殖、迁移、分化和凋亡。我们可通过调节宿主上皮屏障的防御功能及炎症微环境中免疫细胞和炎性因子的活性来治疗牙周病，可能为预防牙周炎、研究牙周炎的发病机制及炎症过程中细菌的致病性提供了新的视角。