釉基质衍生物在口腔医学领域的研究进展

    釉基质衍生物（enamel matrix derivatives，EMD；商品名：Emdogain）是从幼猪牙胚中提取的釉基质蛋白的衍生物，其组成成分复杂，包含多种蛋白质成分和生长因子。EMD的主要成分为釉原蛋白，占总蛋白含量的90%以上，是釉基质蛋白中的主要活性成分；釉蛋白、成釉蛋白等非釉原蛋白的质量分数虽不足10%，但在信号传导和细胞矿化过程中起着重要作用；除上述成分外，EMD中还存在着转化生长因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2及BMP-4等生长因子，发挥着诱导细胞分化等作用。
    EMD的组成成分复杂，是模拟天然矿化的微环境和发挥矿化功能的前提与基础。现有研究表明，EMD具有促进牙周组织再生、诱导骨组织形成和生物矿化等生物学特性。自1997年瑞典的一个研究小组发现EMD可作为一种具有牙周再生能力的生物制剂后，其被广泛用于牙周再生领域。近年来，EMD在自体牙移植、直接盖髓治疗、种植体周围炎等临床应用也越来越多，并取得了较好的疗效。
    1.EMD促进细胞矿化的机制研究
    已有研究表明，EMD能够促进多种细胞的黏附、迁移、增殖和分化等生物学行为，以及上调细胞内各种转录因子、细胞外基质成分和其他参与矿化过程的调控分子的表达。本课题组将EMD和牙周膜干细胞共培养，在共培养的第2天发现，光镜下见细胞表面形成散在的EMD蛋白聚集体，这和以往的研究报道结果一致，即将EMD溶液置于生理状态下的pH和温度时，会诱导EMD蛋白聚集体的形成。
    Hammarstrom等认为，EMD促进细胞增殖和蛋白质合成的能力，可通过细胞-EMD基质相互作用来解释，EMD聚集体还可吸收并富集培养液中的各种生长因子，从而增强与细胞的交互作用，提高细胞的生物学活性。Ando等在研究釉原蛋白对人脂肪细胞来源的间充质干细胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）的作用时发现，EMD可通过MAPKERK信号通路增强hADSCs的增殖能力，促进hADSCs向成骨细胞、牙骨质等方向分化。
    Villa等将EMD混合蛋白分离提纯后发现，EMD中不同分子量的蛋白具有不同的功能，如低于20ku的蛋白具有更明显促进特定细胞增殖的作用，而高于20ku的蛋白可促进靶细胞分泌血管内皮细胞生长因子和白细胞介素6等，该结果表明，EMD中的某些特定组分发挥着促进干细胞增殖和分化的作用。
    余晓宏等的研究表明，EMD对人牙周膜干细胞（humanperiodontal ligament stem cells，hPDLSCs）的增殖有促进作用，用其处理hPDLSCs后，细胞中与合成细胞外基质（extracellular matrix，ECM）相关的基因表达水平升高，骨钙素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型胶原（collagen type Ⅰ，CoL-Ⅰ）等的表达水平明显提升；Zou等的研究表明，EMD可促进CoL-Ⅰ和基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）的表达，证实CoL-Ⅰ和MMP-1参与了牙周组织的再生和重塑过程。
    牙骨质的再生是牙周再生的重要环节，而成牙骨质细胞的形成和功能性活动则是牙骨质再生的细胞学基础。牙齿发育期，Hertwig′s上皮根鞘的内层细胞分泌的釉基质蛋白，能够促进牙周膜再生和参与无细胞牙骨质的形成。因此，EMD很可能是在牙周再生过程中刺激hPDLSCs增殖，并可能诱导其向成牙骨质细胞或成骨细胞分化。王珏等研究发现，EMD能够促进ECM分泌和胰岛素样生长因子1（insulin like growth factor 1，IGF-1）、TGF-β1等表达水平上调，通过增加功能细胞数量、上调矿化相关基因表达水平来促进PDLSCs的成骨或成牙骨质分化，并具有明显的特异性。
    有研究表明，EMD可通过调节成骨细胞间通信和黏附分子的表达，促进其分化和矿化。骨涎蛋白（bonesialoprotein，BSP）是一种高度糖基化的骨基质蛋白，是成骨细胞分化的标志，其表达在骨钙化中发挥重要作用。骨钙素（osteocalcin）是一种含有5.7ku羧谷氨酸的蛋白，已被证明可调节骨形成和矿化，并被认为是成骨细胞成熟的最后阶段的标志。
Hisanaga等和Mrozik等先后在研究中表明，EMD可提高BSP的mRNA表达水平，而使骨钙素的表达持续降低，这意味着有必要进行下一步的研究，以阐明EMD是否参与促进成骨细胞分化和矿化的最后阶段。此外，有研究证实，EMD可通过TGF-β/Smad2信号通路调节人牙龈成纤维细胞和口腔上皮细胞的增殖和成熟等生物学行为。
    2.EMD用于牙周病治疗的研究
    目前，EMD应用最多的还是牙周再生领域，在过去二十多年的研究中，EMD表现出良好的牙周缺损的修复效果，不仅能促进hPDLSCs的增殖和分化，还能促进无细胞性牙骨质再生，且能够在组织学上呈现出真正的牙周组织再生。Seshima等评估了EMD用于22例慢性牙周炎患者的治疗效果，随访2年后发现，临床附着水平（clinical attachment level，CAL）均较基线有显著改善，同时牙周探诊深度（probing depth，PD）也有显著下降，提示EMD治疗慢性牙周炎有良好的临床效果。
    Artzi等在28例侵袭性牙周炎（aggressive periodontitis，Agp）患者的治疗中，分别使用了引导组织再生（guided tissue regeneration，GTR）和EMD这两种牙周再生技术，并进行了术后10年的随访，通过统计分析患者的平均邻面探诊深度（proximal probing depth，PPD）、CAL和牙龈萎缩情况，发现两组患者的PPD和CAL均有显著降低，且两组之间无较大差异，认为这两种方法对Agp患者具有相似的临床治疗效果。
    Seshima等应用EMD对22例牙周骨内缺损深度大于3mm的慢性牙周炎患者进行了治疗，在治疗1、2年后分别进行CAL和PD的检测，结果显示两者均有较大程度的改善，提示EMD用于治疗骨内缺损具有较好的效果。种子细胞、生长因子和支架材料是牙周组织工程的三要素。支架材料是细胞获取营养、废物排泄和气体交换的场所，是新组织形成的基础，EMD与支架材料的联合使用已广泛应用于临床。
    Lee等设置对照研究，评估了EMD与猪脱矿骨基质（demineralized porcine bone matrix，DPBM）支架材料的联合使用，在修复磨牙区单壁牙周骨内缺损方面具有潜在优势，修复后6、12和24个月测量PPD、CAL、牙周缺损深度、牙周缺损宽度及术后情况（疼痛和肿胀的严重程度及持续时间），结果显示两者的联合使用可显著改善各项临床指标，并可明显减少术后不良反应。
    可吸收胶原海绵（atelocollagen sponge，ACS）被认为是生长因子的合适支架或载体，Hisanaga等将EMD加载至ACS支架，然后研究其对体外培养的小鼠诱导多能干细胞（mouse induced pluripotent stem cells，miPSCs）的细胞行为及分化的影响，结果显示，EMD联合ACS支架组矿化水平和钙含量明显高于对照组，表示EMD联合ACS可增强miPSCs的成骨分化和矿化能力。
    目前已证明，糖尿病和牙周病互为发病因素，具有双向关系。糖尿病患者免疫力受到影响，具有更高的牙周患病率和进展率，而近年来糖尿病患者数量呈明显的上升趋势，因此糖尿病患者的牙周病治疗将是一个重要问题。Takeda等将36只大鼠分为链脲佐菌素诱导的糖尿病组和对照组（非糖尿病组），经双侧上颌骨磨牙手术产生三壁骨内缺损，然后分别应用EMD或生理盐水，最后通过组织形态学分析和显微计算机断层扫描来评估缺损的重建情况，结果显示，糖尿病组经EMD处理后新形成的骨和牙骨质明显增加，提示在糖尿病患者中EMD的应用对牙周组织再生也有很大益处。
    3.EMD用于牙再植及牙移植的研究
    牙再植和牙移植成功的关键是牙周膜再附着，EMD已被证明能够促进新生牙周膜纤维功能性排列，因此近年来也有学者将其用于牙再植及牙移植的研究。2009年，Al-Hezaimi等在1例15岁患者上颌侧切牙的治疗中，联合应用了根管治疗术、意向性再植术和EMD，随访4年患者感觉良好，经放射线检查发现根尖周病理影像完全消失，未发生炎症性牙根吸收，也无感染迹象。
    然而，Tuna等将刚刚拔除的比格犬单根切牙和前磨牙分别用重组碱性成纤维细胞生长因子2（basic fibroblast growth factor，bFGF2）和EMD处理，再将其重新植入牙槽窝中，8周后经组织病理学检查和形态计量学评估发现，EMD组牙根吸收发生率大于bFGF2组，且主要表现是可转变为骨粘连的置换性吸收，提示EMD作为牙脱落后的保存介质用于防止牙齿延迟再植后的牙根吸收和骨粘连的效果并不显著。因此，在牙移植及牙再植领域，近年来的研究得到的结果并不统一，EMD的效果并没有得到充分地认可，但仍有部分治疗成功的临床病例。这提示，EMD在牙再植及牙移植中的应用，仍需要大量的临床试验来证明其作用效果。
    4.EMD用于直接盖髓治疗及对牙髓干细胞的作用研究
    直接盖髓治疗的目的是保护牙髓活力并促进牙根的持续发育，其成功的决定因素是修复性牙本质、新生血管的形成和牙髓细胞活力的增强，其远期效果与盖髓材料的种类密切相关。目前，常用的材料包括：矿物三氧化物凝聚体（MTA）、氢氧化钙［Ca（OH）2］、硅酸钙粘接剂（Biodentine）和EMD等。Youssef等比较了MTA、Ca（OH）2、Biodentine和EMD在体外对牙髓干细胞的成骨、成牙和血管生成作用，并检测被测材料对细胞活力的影响，结果表明，MTA、Biodentine和EMD三者具有相似的属性，并比Ca（OH）2的效果更好。
    Dahake等用茜素红S染色法和MTT法评价了EMD、MTA和Biodentine对人脱落乳牙干细胞的诱导分化潜能和对细胞活力的影响，结果发现，EMD组具有很高的细胞存活率和增强牙本质涎蛋白矿化和表达的潜力。然而，Wang等综合分析了EMD作为直接盖髓剂的17例动物研究和12例临床研究，认为EMD与传统的盖髓材料相比并无任何明显的优势，并指出在再生过程中，EMD处理主要用于诱导牙根外表面根尖区域形成牙骨质样组织，以及向根管腔内长出新形成的硬组织，且EMD处理牙齿的5年和10年预后还不清楚，因此需要更长随访时间的研究来证明EMD的长期疗效。
    5.总结与展望
    EMD的组成成分复杂、功能多样，是能够促进牙周再生及新的牙骨质形成的生物材料。通过多年来的相关基础研究和临床应用，我们已经了解了EMD的生物学作用机制及其用于慢性牙周炎、直接盖髓、牙移植等口腔治疗的效果；然而，EMD对机体细胞及组织行为的影响研究不够深入，临床应用效果也尚未统一，需要更多和更长时间的临床研究证明其矿化机制和作用，使其在临床上的应用更明确、更广泛。