循环肿瘤细胞与口腔鳞状细胞癌相关性的研究进展

2022-1-4 17:01  来源:国际口腔医学杂志
作者:甘建国 高攀 王晓毅 阅读量:10504

    唇、口腔及口咽部恶性肿瘤近年来也成为了严重危害人类生命健康的重大疾病,约占总恶性肿瘤的3.8%,死亡人数约占3.6%,且均呈上升趋势。在中国,其死亡人数预计约占发病人数一半,而北京地区仅口腔、口咽部发病率就约占其47.4%。
    越来越多证据表明,肿瘤细胞可早期从原发部位进入血液循环,甚至早于机体出现相应临床症状。进入血液循环的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)可沿着血液系统播散至全身各处,严重影响肿瘤患者的早期诊断和治疗,可增加肿瘤转移或复发概率,降低患者生存率,且导致无法对治疗疗效进行评价和判断。由于CTCs数量相对较少(106~107个外周血白细胞中才有1个循环肿瘤细胞),其富集和研究技术非常困难。
    近年来,随着检测技术的进步,CTCs已应用于肺癌、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌等肿瘤中,用于指导肿瘤的早期诊断、治疗、疗效评价和预后判断。但关于口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC) 的研究及临床运用鲜有报道。本文对OSCC相关CTCs的研究现状作一综述,探索OSCC相关CTCs生物标志物的临床意义,了解CTCs 与OSCC进展及预后的关系,为通过靶向CTCs治疗OSCC奠定理论基础。
    1. CTCs 在OSCC中的形成与发展
    CTCs是从原发灶脱落、释放并转移到血液中,与肿瘤转移有关的细胞。其在OSCC中形成机制尚不十分清楚,大致过程分为:1) 上皮间充质转化形成,2) 进入血液循环,3) 逃避宿主免疫清除,4) 转移到远处组织。
    1.1 OSCC中上皮间充质转化的结果
    大量研究表明,上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT) 在肿瘤细胞迁移过程中起着重要作用。EMT可使上皮细胞的形态结构发生改变、细胞极性丢失;细胞间黏附分子E-钙黏蛋白表达被抑制,导致紧密连接丧失;同时,细胞骨架结构重组,由角蛋白转变为波形蛋白为主的细胞骨架。一系列变化导致OSCC上皮细胞黏附能力下降,可塑性增强,从而获得迁移和侵袭能力,进而能够突破基底膜,从原发灶浸入周围血管中形成CTCs。
    EMT主要由转录调控、选择性剪接、非编码RNA调控和翻译后修饰等相互关联且密切联系的环节所调控的,形成一张EMT调控网络。而EMT诱导转录因子(EMT-inducing transcription factors,EMT-TFs) 构成了调控网络的大体框架。EMT-TFs促进细胞呈现间充质表型,使上皮表型处于沉默状态。EMT-TFs水平因肿瘤异质性而表达不同,在头颈部鳞状细胞癌中Snail1、Snail2、ZEB1、ZEB2、TWIST1等都呈上调趋势。
    有研究发现,EMT还存在中间状态,即上皮型与间充质型混合的表型。关于肿瘤异质性与EMT表型相关性的猜想也相继提出,但目前尚缺少证据证实OSCC异质性与EMT之间的关系。此外,间充质阿米巴样转化(mesenchymal amoeboid transition,MAT) 除了在淋巴瘤、小细胞肺癌等在OSCC中也被观察到。间充质细胞在低黏附和强束缚条件下可向阿米巴样迁移转化,在不发生特异性基因改变的情况下自发地逃离原发灶。
    与EMT相比,MAT通过增加细胞收缩性,穿过不同孔径、形状的间隙,从而速度更快。在OSCC中不同生存条件下可能存在上皮细胞转化为间充质细胞,然后再转化为阿米巴样细胞,若这一连续过程发生将会大大提高OSCC的复发率和转移率。
    1.2 OSCC中CTCs 逃避宿主免疫清除的机制
    影响CTCs在血流中存活的主要因素有多个方面,如细胞锚定丧失、血液机械应力和免疫系统攻击等。失巢凋亡为细胞在迁移过程中丢失与细胞外基质黏附作用而导致的一种程序性死亡,特别是上皮细胞。CTCs可活化特定的生存信号避免失巢凋亡;或通过调节黏附分子的表达,稳定与细胞外基质的接触,影响下游相关信号通路,阻止诱导死亡信号。
    脱离原发灶和细胞外基质,血流剪切力、血管内高压以及机械形变等血流动力学机械应力均可以诱导CTCs死亡。绝大多数CTCs由于血液的机械作用而发生死亡或凋亡,剩下少数CTCs将面临被机体免疫系统清除的可能。自然杀伤(natural killer,NK)细胞表面NKG2D受体可识别肿瘤细胞表面分子MICA和MICB,激活固有免疫应答。
    也有研究表明,一些肿瘤细胞可通过金属蛋白酶使MICA、MICB等NKG2D配体脱落,导致配体数量减少,从而逃脱免疫清除。除了CTCs自身调控与改变,血细胞也起着“帮凶”的作用。血小板可直接摄取CTCs释放的蛋白质和mRNA,而CTCs可直接刺激血小板的活化和蛋白合成,最终形成肿瘤相关血小板(tumor-educated platelets,TEPs)。
    TEPs与CTCs表面受体结合,导致NK细胞不能直接与受体结合激活相关通路,从而协助CTCs逃脱免疫监测。中性粒细胞被证明可抑制NK细胞功能促进肿瘤细胞免疫逃逸;分泌白细胞介素1β和基质金属蛋白酶促进肿瘤细胞的转移。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs) 可捕获CTCs,分泌相关细胞因子,延长CTCs细胞周期,促进转移。
    当TEPs和中性粒细胞积聚在CTCs周围,其分子间相互连接和作用可增加CTCs对血流动力学的耐受能力以及在血管中的黏附和滞留,从而穿过血管内皮屏障,外渗到远处组织后形成弥散性肿瘤细胞(disseminated tumor cells,DTCs)。当然CTCs也能随着血液循环重新定植到原发灶,进一步促进原发灶的生长,这种现象叫做CTCs归巢。CTCs聚集成簇的机制尚存在很多争议,回顾文献总结为以下机制:1) 肿瘤细胞成簇脱落渗入血管;2) 单个CTC在血管内增殖成簇;3) CTCs与血细胞相互作用表现成簇,并和血管内其他物质结合形成循环肿瘤微栓子(circulating tumor microemboli,CTM)。
    研究显示,单个与成簇CTCs的基因表达图谱存在差异,这种差异可能导致成簇CTCs比单个细胞更有效地定植并形成转移。成簇CTCs可维持细胞间接触使内部细胞免受免疫攻击,更大程度上保留原发肿瘤的特征与表型,从而迁移转移能力更强。
    1.3 OSCC中基于CTCs 的转移定植过程
    OSCC的转移定植是复杂的过程,而CTCs则是贯穿整个过程的关键。有学者认为,肿瘤的转移扩散可能遵循2种模式:血运转移和依赖于淋巴系统的转移。在后者中,肿瘤细胞早期从原发灶扩散到淋巴结,并在淋巴结中增殖。随着增殖扩散,肿瘤细胞再次突破淋巴结周围血管进入循环系统转移到远处器官,形成转移病灶。
    口腔颌面除血供丰富以外,还有密集的淋巴结群,而颈部淋巴结转移、转移数量和淋巴结外扩散都是OSCC重要的预后因素,可使患者的生存率明显降低。与乳腺癌相比,在OSCC中远处转移与淋巴结转移之间的关系会更加密切。
    目前尚无有力证据揭示这两种转移方式之间的具体关系,在早期OSCC中是以非依赖淋巴结的血运转移为主还是以依赖淋巴结的血运转移为主;或淋巴结转移是否会促进加强血运转移,使得CTCs的数量出现明显增加从更容易发生早期转移;再或者两者在肿瘤早期同时出现并相互刺激,影响患者预后。这些亟待解决的问题也为OSCC中CTCs的研究提供了新的方向。
    2. OSCC中常用的CTCs检测方法
    CTCs检测技术也被称为液体活检技术,主要由富集(分离) 和检测(鉴定) 2个部分组成。
    2.1 依赖抗原或标签的方法——免疫磁珠分离法
    2.1.1 阳性分离方法
    在OSCC中常用的阳性分离法是利用OSCC上皮细胞表达的上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)作为富集分离手段,如CellSeach、AdnaTestTM、Mag-SweeperR等。CellSeach系统是目前美国食品与药品监督管理局批准的CTCs检测技术,被认为是检测CTCs的金标准。以上基于EpCAM的方法具有一定的局限性,有可能漏检EpCAM阴性或表达下调的CTCs。此外与EpCAM抗体结合后还可能改变CTCs的原始状态,降低进一步生物学研究的可靠性。
    2.1.2 阴性分离方法
    在OSCC中常用的阴性分离方法是利用CD45标记白细胞,并将其清除,从而留下未被标记的CTCs。基于这一原理的有Easy-SepR和RosetteSepR系统。PowerMag系统比Easy-SepR系统能更有效地清除CD45阳性的白细胞,也能更有效地回收CTCs。但这些技术不可避免地导致CTCs纯度比直接利用CTCs的阳性技术低,且白细胞清除过程也可能导致表达CD45的非传统CTCs被意外删除,导致CTCs被低估。
    2.2 不依赖抗原或标签的方法——基于细胞大小分离法
    基于上皮肿瘤细胞大小分离法(isolation by size of epithelial tumor cells,ISETTM)使用过滤装置优先捕获直径大于8 μm的肿瘤细胞,该技术不依赖于CTCs表面分子,不需要样品预处理,允许使用高流速检测。该方法可用于包括非上皮源性的肿瘤细胞。ISETTM避免了EpCAM表达下调的问题,但存在细胞大小重叠的现象,并且干细胞样CTCs比普通CTCs更小且更具有侵袭性,对肿瘤转移定植研究具有重要的意义。而Park等通过细胞变形能力分离CTCs和白细胞来提高灵敏度。该研究证实,基于变形能力的分离方法更能提高富集能力,这提供了一种高选择性的物理富集过程。
    2.3 微流体芯片技术
    第2代微流体芯片技术包括CTC-Chip和Herringbone-Chip(HB-Chip),然而这2种芯片富集后的细胞活力往往受到损害,会影响下游分析和功能研究。第3代微流体技术CTC-iChip将基于细胞大小的分离法与阳性分离法或阴性分离法相结合,提高了CTCs捕获率和处理速率。CTC-iChip结合了2个微流体芯片。在CTC-iChip1中减轻全血体积,有核细胞通过确定性侧向位移从整个血液中分离出来。在CTC-iChip2中完成磁力分离,通过磁泳技术从未标记的CTCs中将其分离。
    2.4 CTCs 相关新技术
    2.4.1 免疫组织化学成像分析法
    高清CTCs成像实验(high definition-CTC assay,HD-CTC) 可以在不依赖细胞表面蛋白的基础上富集并高清地呈现出CTCs。研究显示,HD-CTC 技术较Cell-Search系统检出率更高并能从88%的转移性癌患者血液中检测出CTCs簇的存在。目前尚无研究在OSCC中运用HD-CTC技术。
    2.4.2 纳米结合技术
    纳米技术的飞速发展,近年来也受到了科研人员的广泛关注。磁性纳米颗粒可与CellSearch结合富集血液样本中的CTCs,显示出强大的临床应用潜力;纳米材料能更容易地进行多种路径检测和分析,这有助于对CTCs异质性的了解。该技术可开发用于研究OSCC异质性与EMT表型之间的关系,用于揭示OSCC转移和复发的个体差异性。
    2.4.3 体内捕获装置
    CellCollectorR已用于捕获体内的CTCs。在体内应用时,通过标准导管进入患者静脉30 min,功能化表面直接与血管内的细胞接触,EpCAM(+) 细胞被捕获。从患者体内取出后,黏附的CTCs可以进行免疫细胞化学染色和评估。目前该技术尚未普及,但可预计其未来发展,或用于OSCC患者术中检测CTCs,可精准评估OSCC外科操作对CTCs数量的影响。
    3. CTCs 在OSCC 中的研究现状
    3.1 CTCs 与OSCC临床的关系
    学者们证实了CTCs在头颈部鳞癌(head neck squamous cell carcinoma, HNSCC) 中存在。在CTCs计数与临床病理因素的关系分析中,Buglione等运用CellSearch技术在1项回顾性研究中发现,Ⅳ期口咽癌患者较Ⅰ至Ⅲ期患者的更易检出CTCs,但差异无统计学意义。Bozec等用相同的技术评估HNSCC中CTCs与临床因素的关系显示,CTCs与患者的年龄和淋巴结转移存在关系。而Kawada等运用微滤系统CellSieve分析后认为晚期(Ⅲ/Ⅳ期)患者的CTCs计数明显高于早期(Ⅰ/Ⅱ期)患者;同时CTCs计数与T分级相关,T3/4患者的CTCs明显多于T1/2患者。
    CTCs计数与OSCC的TNM分期相关,越是晚期或复发或淋巴结转移的患者,其血液中CTCs检出率越高。而CTCs阳性的OSCC患者的复发率较高,局部淋巴结转移率较高,肿瘤多为晚期。与其他临床病理特征如年龄、性别和肿瘤组织学等没有相关性。
    3.2 CTCs 与OSCC预后的关系
    Gröbe等采用CellSearch技术在一项纳入了110例OSCC术后未补充放化疗患者的CTCs与预后关系的研究中揭示CTCs是OSCC患者无瘤生存期的重要独立预测因素和独立预后标志物,在不同疾病阶段预测复发的敏感性高于常规分期。同样的,有学者采用阴性分离方法EasySepR对同步放化疗的HNSCC患者的研究中显示,CTCs计数的变化与无进展生存期和总生存期相关。
    多因素分析发现,CTCs下降状态是无进展生存期和总生存期的独立预后因素。然而不同的是,Tinhofer等检测了144名HNSCC术后补充放化疗患者的CTCs的前瞻性研究结果认为总体上CTCs不能预测患者的总生存率和无瘤生存率。纳入17项研究的Meta分析发现,CTCs检测阳性与总生存期、无瘤生存期和无进展生存期显著相关。
    而另外一项纳入了20项研究的Meta分析也得出来相似的结论,同时还发现T3-T4组、N1-N3组、Ⅲ-Ⅳ组的CTCs阳性率较高。这2项Meta分析虽然并未将OSCC单独列出,其数据分析包含了所有类型的HNSCC。从总体数据和相关的研究来看,CTCs是OSCC的1种预后标志物,且与总生存期、无瘤生存期和无进展生存期显著相关。
    3.3 OSCC中CTCs 新型标志物
    除此之外,其他新型生物标志物也相继提出。研究发现,同一患者的单个和成簇CTCs的盘状球蛋白的表达具有明显差异,敲减plakoglobin基因后终止了成簇CTCs的形成。而另一项研究发现plakoglobin在OSCC中过表达,能够促进OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡。原发灶中plakoglobin 的高表达或许可作为定性判断CTCs数量或成簇的标志物,也可成为OSCC的潜在预后标志物,这也从另一个角度解释了OSCC中CTCs 成簇的机制。平足蛋白(podoplanin,PDPN) 已被证实一种OSCC预后不良的生物标志物。
    Hsieh等对PDPN在CTCs中的表达对预后的影响研究中,注意到无论治疗方式和肿瘤分期,PDPN+/EpCAM+-CTCs比值都是一个独立的预后因素。目前尚无研究将上述比值用于OSCC的临床评估。但将2种生物标志物相结合的方法,不仅仅能提高预测的灵敏度,也可能为OSCCD的临床运用提供新的视角。程序性细胞死亡受体-1 (programmed cell death receptor-1,PD-1) 与其配体PD-L1结合后可启动T细胞程序性死亡,而PD-L1在CTCs中呈现高表达会影响OSCC的预后。
    Strati等在纳入113名HNSCC患者的研究中通过多因素分析发现治疗结束时CTCs高表达PD-L1是无进展生存期和总生存期的独立预后因素。治疗结束时PD-L1无过表达与完全缓解密切相关。PD-L1或将成为预测OSCC预后的新标志物,且目前PD-L1作用机制研究比较明了,有望将PD-L1与其他标志物相结合用于检测OSCC患者中的CTCs,从而降低OSCC的转移与复发,且PD-L1阳性的CTCs可以用来监测OSCC对治疗的反应,成为药物治疗OSCC新的靶点。目前,PD-1的抗体可用于治疗复发或转移性HNSCC,随着阳性临床数据的出现,将使更多患者获益。
    3.4 CTCs 与OSCC治疗手段的关系
    手术治疗仍然是OSCC目前最主要的治疗手段,而机械操作导致肿瘤细胞脱落的讨论研究也一直备受关注。为探讨外科操作与OSCC血循播散的关系,有学者发现,外科机械操作有促进肿瘤细胞血运转移的可能。Jatana等对38例HNSCC患者术前术后的76份血样进行了检测,有60.5%的患者术后每毫升CTCs数量平均增加6.63倍。
    由于丰富的血管和淋巴,在OSCC手术中外科侵袭性操作不可避免的促进了癌细胞进入血液形成CTCs,增加肿瘤远处转移的风险。可以利用体内捕获装置CellCollectorR在进行外科操作时进行体内检测并富集CTCs,指导OSCC的治疗、监测治疗反应以及判断预后,以达到减少远处转移或复发的风险,但由于该技术弊端在于属于有创性操作,患者接受度和配合度较低,且对外科操作要求较高,所以开展相关临床研究尚有一定的困难。
    4.结束语
    综上所述,CTCs与OSCC的TNM分期相关,可以作为判断OSCC预后的指标之一,可与其他生物标志物联合评估OSCC的预后。但关于OSCC的CTCs研究较少,且多包含在HNSCC的研究中,缺少同质的OSCC相关研究,可能导致评估存在差异。关于检测技术,目前多用CellSearchTM系统检测OSCC中的CTCs。随着技术发展,未来CTCs的检出会更加灵敏和便捷,有望将CTCs检测技术用于OSCC相关的体内实验和治疗当中。
    针对不同EMT表型的OSCC,可开展大样本研究,以进一步了解OSCC中EMT与CTCs异质性的关系以确定不同群体中CTCs对于预后影响的差异,并有助于临床干预,以提高肿瘤的治疗效果。此外,目前尚缺乏OSCC相关的CTCs体内研究,用于指导外科操作以减少机械操作导致肿瘤细胞脱落的可能性。OSCC的CTCs体外内研究将有助于阐明OSCC具体转移机制以及抗肿瘤载体的机制,为靶向CTCs治疗OSCC奠定理论基础。

编辑: 陆美凤

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