放化疗性口腔黏膜炎相关生物标志物研究进展

    放化疗性口腔黏膜炎（radio therapy and/or chemotherapy induced oral mucositis，RTOM/CTOM）是指在放疗和（或）化疗时发生在口腔黏膜的炎性状态，临床表现为口腔黏膜烧灼样疼痛、红肿、糜烂及溃疡，影响着多达80%的接受放射治疗和大约40%的接受化疗的患者。
    严重的RTOM/CTOM会明显降低患者的生活质量，影响患者吞咽、言语、进食功能从而影响患者营养状况、舒适度、以及抗肿瘤治疗。目前研究尚未完全阐明口腔黏膜炎的发病机理，RTOM/CTOM被认为是由于放射线和（或）抗癌药物等细胞毒性物质作用而引起的一系列复杂的、动态的生物化学反应过程，涉及DNA损伤，上皮、结缔组织和黏膜下组织之间的多种信号传递及相互作用。
    生物标志物是在疾病发生前或过程中在不同生物学水平上出现的信号指标，RTOM/CTOM相关的生物标志物通常是机体代谢途径中产生的结构、物质，可用于诊断、预后以及预测治疗干预的过程或药理学反应，可以被准确及重复测量。
    生物标志物主要是蛋白质类，可在血液、唾液或身体组织中检测到，依此来了解患者患RTOM/CTOM的风险是否增加，早期识别容易发展成严重RTOM/CTOM的患者，并有助于监测和表征这种不良反应，以及制定一些干预方案预防病情发展。本文通过综述不同生物标志物在RTOM/CTOM中发生的变化及意义，以期对RTOM/CTOM相关研究及临床防治提供一定的参考。
    1.生长因子
    生长因子是指具有刺激细胞生长活性的细胞因子，在RTOM/CTOM的发展及愈合中，生长因子具有重要作用，调节细胞的生长与炎性反应，不同生长因子的作用不尽相同。
    1.1上皮生长因子
    上皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）可调节上皮细胞的增殖、生长和迁移，维持上皮屏障，参与修复受损黏膜。研究发现，患者接受放疗的过程中，唾液EGF含量一直减少且放疗初期减少显著，同时，EFG含量与RTOM的严重程度存在显著的负相关。动物研究显示，重组人表皮生长因子促进黏膜伤口愈合过程，相关制剂（如凝胶、口服喷雾等）被应用于治疗口腔黏膜炎。此外，与其类似的生长因子，如粒细胞集落刺激因子、角质细胞生长因子（如帕利夫明）等同样被应用于防治口腔黏膜炎。因此，在EGF已经作为常见RTOM/CTOM生物标志物之一的同时，推测其类似物也有同样的潜力。
    1.2血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子
    血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）参与了肉芽组织的形成。VEGF在上皮细胞和间质的生长和代谢，尤其是新生血管的再生中有着重要的作用，bFGF可以刺激上皮增殖，参与并维持结缔组织中血管的生成和成纤维细胞的生长。VEGF和bFGF作为生物标志物在接受放疗和（或）化疗的肿瘤患者的唾液中被证明是增加的。但是也有研究显示在大鼠RTOM病损组织中检测到当血管变化以损伤为主，没有新生血管的形成时，VEGF变化不大，甚至随时相呈下降趋势。因此，VEGF和bFGF作为RTOM/CTOM的生物标志物，具有潜在临床应用价值。
    1.3其他生长因子
    有研究报道其他生长因子也参与了组织的炎症和修复过程。转化生长因子β作为有效的上皮细胞生长抑制因子，在小鼠放射性口腔黏膜炎实验模型中，其蛋白和信号活性均有增加。而在仓鼠放射性口腔黏膜炎实验模型中，转化生长因子α参与的信号通路具有促进角质形成细胞迁移和增殖的能力。但是否可以成为CTOM/RTOM的生物标志物还需更多研究证实。
    2.炎性细胞因子
    促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNFα）、白细胞介素（interleukin，IL）如IL1β、IL6、IL8等，是在口腔黏膜炎发展过程主要由黏膜下层和基底层产生的细胞因子。而另一方面，产生的抗炎细胞因子，如IL10和IL11，可以降低黏膜损伤。正常情况下，两类炎性细胞因子处于动态平衡，促炎性细胞因子主要由Th1细胞分泌，与口腔黏膜炎的损伤程度呈正相关；抗炎性细胞因子由Th2细胞分泌，可以抑制过度炎性反应，保护黏膜。
    2.1TNFα
    TNFα上调可能激活caspase通路，并通过核转录因子NFκB反馈放大其反应，启动丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路，激活JNK信号，导致黏膜下和基底上皮细胞凋亡，促进黏膜溃疡发展。临床试验中TNFα基因（1211T>C，rs1799964）为C/C基因型的患者血浆TNFα浓度显著高于其他基因型（10.70vs9.62ng/mL，P＝0.008），且血浆TNFα高浓度组与放疗后5周患者发生更严重口腔黏膜炎的风险有关（OR＝7.33，P＝0.031），同时研究表明唾液中的TNFα可能是一个更加准确的RTOM/CTOM诊断和治疗所需的生物标志物。
    2.2促炎性白细胞介素
    IL1β、IL6、IL8作为炎症介质，在感染、应激等外界条件的刺激下，其胞内前体经剪切、修饰释放到胞外，从而诱发局部或系统性炎症。大鼠RTOM的病损黏膜上皮组织中IL1β水平显著上升，诱导黏膜下层血管内皮生长因子表达，促进血管生成，募集炎性细胞，放大炎症反应。研究表明放疗和（或）化疗患者唾液中IL1β、IL6、IL8水平明显升高，且IL1β、IL6与黏膜炎性反应程度呈正相关，在治疗开始后3周，IL1β和IL6水平的增加可以预测口腔黏膜炎的恶化，可作为早期诊断黏膜炎高危患者的潜在生物标志物。但也有研究表明IL6在RTOM中具有双重作用，既能促进RTOM的发展又具有抗炎性质，目前大部分研究认为IL6是RTOM的致炎因子。
    2.3抗炎性白细胞介素
    IL10、IL11具有下调炎症反应和黏膜保护的作用。IL10作为研究较多的生物标志物之一，在患者唾液和血清中均被证明是增加的。而IL11在受损组织中由上皮细胞分泌，参与免疫调节、抑制炎症、增加基底细胞增生以及抑制细胞凋亡，在放化疗中保护基底层和口腔黏膜。
    在临床中IL11雾化剂已被用来治疗口腔黏膜炎并能够改善患者的临床症状及食欲，促进伤口愈合。
    3.基因
    近年的研究认为DNA损伤修复和细胞凋亡是RTOM/CTOM的发展基础，DNA链断裂直接或通过活性氧（reactive oxygen species，ROS）、核转录因子NFκB间接导致黏膜下层细胞和黏膜上皮细胞损伤。虽然目前基因和RTOM/CTOM相关机制的关联特征尚不清楚，但是研究表明某些基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）能作为潜在生物标志物，在患者进行放化疗之前对患者RTOM/CTOM的风险及严重程度进行评估预测。而一些基因表达产物的变化也具有一定参考价值。
    3.1DNA修复相关基因
    研究发现，与DNA修复相关的基因例如剪切修复交叉互补基因l（excision repair cross complementing1，ERCC1）、X射线交错互补修复基因1（X ray repair cross complementing 1，XRCC1）、核糖核苷酸还原酶亚单位基因（ribonucleotide reductase subunit M1，RRM1）的不同基因型或表达量和RTOM/CTOM的发生风险相关。ERCCl是核苷酸切除修复复合物的关键部分。有研究表明在放化疗后ERCC1118基因型C/T患者的并发症发生率明显高于C/C或T/T患者，同时T/T患者发生严重并发症的频率高于C/C。XRCC1可以修复单链断裂，参与黏膜基底层的修复。在鼻咽癌患者中观察到，XRCC1399Arg/Gln基因型的患者更易发生严重的RTOM。
    RRM1基因编码核苷酸合成的途径，其功能的改变可以调节细胞DNA修复机制的效率影响患者RTOM的发生率。研究表明，治疗前外周血中RRM1基因的高表达与放疗5～7周时发生严重RTOM的风险显著相关。因此可以通过外周血中RRM1基因的表达来评估患者发生严重RTOM的风险。
    3.2氧化反应相关基因
    研究发现，与细胞氧化反应相关的基因例如环氧合酶2相关基因、缺氧诱导因子1α相关基因、酰基脱肽水解酶（acylpeptidehydrolase，APEH）基因的不同基因型或表达量与RTOM/CTOM的发生风险相关。环氧合酶2相关基因、缺氧诱导因子1α相关基因在正常的颊黏膜组织中几乎不表达，在RTOM/CTOM患者的颊黏膜样本中，由于NFκB的激活与上调通过多种途径诱导导致此类基因的表达增加，并参与炎症反应。
    APEH参与了分解ROS的过程，其基因调控区多态性（c.521G>C，rs4855883）影响着其功能。研究发现其C/C基因型与肿瘤患者发生更严重RTOM的风险和生存率有关。因此APEH基因多态性可作为预测RTOM的生物标志物。
    3.3机体代谢相关基因
    研究发现，与机体代谢相关的基因例如甲酰四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因、脑肠肽（ghrelin，GHRL）基因的不同基因型与RTOM/CTOM的发生风险相关。MTHFR是叶酸代谢的中心，其rs1801131和rs1801133单核苷酸多态性改变其酶活性，MTHFRC677T中部分基因型或部分基因缺失可能导致MTHFR的酶活性降低，增加患者RTOM/CTOM发生率。
    GHRL基因调控区多态性（c.2531C>T，rs1629816）同样影响着肿瘤患者RTOM的发生及严重程度。研究表明GHRL基因型为A/A的头颈部肿瘤患者在放疗6周后发生严重RTOM的风险显著降低（OR＝0.14，P＝0.481）。因此GHRL基因多态性可成为预测RTOM的生物标志物。
    3.4炎性介质相关基因
    研究发现，炎性介质相关基因例如TNFα基因、TNF受体基因特定区域的单核苷酸多态性与RTOM/CTOM的发生风险相关。TNFα基因启动子区域的单核苷酸基因多态性影响TNFα的功能及表达，从而影响口腔黏膜炎的发展及风险。研究发现，TNFα基因（1211T>C，rs1799964）为C/C基因型的患者血浆TNFα浓度显著高于其他基因型且与患者发生严重的RTOM风险相关。因此可以通过TNFα基因的SNPs来预测患者发生RTOM的风险及严重程度。
    肿瘤坏死因子受体超家族成员1A（tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A，TNFRSF1A）（rs4149570）位于TNF受体基因启动子区，其单核苷酸基因多态性（610T>G）影响TNF的功能。研究表明携带T等位基因的患者发生严重RTOM的风险明显高于G等位基因。因此可以通过TNFRSF1A基因的单核苷酸基因多态性来预测患者RTOM的风险及严重程度。
    3.5其他相关基因
    淋巴细胞抗原6复合体（lymphocyte antigen 6 complex，LY6G6C）属于白细胞抗原6基因簇，与MHCⅡ相连，位于细胞表面，参与免疫介导的信号转导。有研究发现，在放疗前，相比并发了严重口腔黏膜炎的患者，不并发或并发轻度口腔黏膜炎的患者中LY6G6C表达上调，但差异无统计学意义。LY6G6C可能是预测放疗后严重RTOM的潜在生物标志物。
    4.血浆抗氧化剂
    血浆抗氧化剂是一种细胞分泌到血浆中的具有抑制自由基的产生、加速自由基的消除或者抑制其对生物大分子氧化损伤作用的保护性物质，其在口腔黏膜炎的发生发展中有着重要作用。在口腔黏膜炎发生的起始阶段，由各种原因引起的DNA损伤导致上皮和血管内皮细胞、成纤维细胞和组织巨噬细胞释放ROS，而ROS在各种炎症性疾病中发挥着增强炎症的关键作用。
    4.1酶促系统抗氧化剂
    人血浆抗氧化剂中酶促系统抗氧化剂主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）三大酶系。SOD、CAT和GPx能够清除ROS及毒性氧化物，调节巨噬细胞和上皮细胞的炎症相关基因，在再生和修复过程中发挥重要作用。RTOM/CTOM中相关抗氧化剂的研究未见报道，但有研究表明口炎患者唾液中SOD和CAT水平较高而GPx较低，同时血清中SOD、CAT较低而GPx较高。但也有研究称活活动期患者血浆GPx水平较低。因此酶促系统抗氧化剂能否成为RTOM/CTOM的生物标志物尚需更多研究确认。
    4.2非酶促系统抗氧化剂
    非酶促系统抗氧化物质包括维生素E（α生育酚）、维生素C（抗坏血酸）、α硫辛酸、β胡萝卜素等。有研究表明血清相关维生素含量较低的患者更易患RTOM/CTOM。其他抗氧化剂在口腔黏膜炎的防治中有一定的作用，但能否作为生物标志物尚未明确提出。
    5.促凋亡/抗凋亡相关蛋白
    细胞凋亡是RTOM/CTOM进展中的一常见过程。细胞凋亡可由线粒体受到损伤，随后线粒体释放凋亡诱导蛋白（apoptosis inducing factor，AIF），DNA发生大规模断裂而引起。而凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）是细胞死亡和存活途径的重要调节因子。RTOM的进程中可以检测到抗凋亡相关基因水平下降；而促凋亡相关基因表达上升，从而上调自噬蛋白与凋亡蛋白表达，升高血清炎性因子含量。
    5.1AIF
    AIF通常位于线粒体内膜发挥细胞保护作用，而口腔黏膜炎中ROS的积累启动细胞保护机制，通过p53信号增加线粒体外膜通透性，AIF作为一个强有力的促凋亡触发器被释放到细胞质与细胞核中，触发细胞凋亡级联。体外细胞实验发现，在病毒性感染引起的炎症细胞中检测到表达AIF的线粒体比例分数显著降低，而AIF的细胞核分数在感染后24h明显升高，并随感染时间的延长而升高。因此认为AIF具有作为RTOM/CTOM生物标志物的潜力。
    5.2IAP
    IAP包括多种因子，其中cIAP1或cIAP2对TNFα诱导的细胞凋亡有保护作用，cIAP1和cIAP2的缺失对NFκB对TNFα的信号转导有明显的抑制作用。cIAP活性对线性泛素化连接酶向信号复合物的募集起重要作用，线性泛素化连接酶组分的丢失可诱导小鼠炎症。有研究表明缺乏cIAP1或cIAP2或XIAP的小鼠在子宫内死亡，所有IAP的髓系特异性缺失甚至会导致无菌性炎症。IAP能否在RTOM/CTOM中作为生物标记物尚未提出。
    6.其他
    C反应蛋白（C reactive protein，CRP）是一种急性时相反应蛋白，参与多种生理及病理过程，可通过诱导增加IL1受体的表达量以及释放IL10发挥抗炎作用。研究表明RTOM患者血清CRP较高，且随着放疗剂量增加而不断升高，而采用能有效减轻口腔黏膜炎的药物可以明显有效降低放疗患者CRP水平。目前已有研究设计了较传统ELISA更快速、低成本的检测方式，通过综合血清中CRP和其他炎性细胞因子（TNFα、IL6以及IL1β）作为生物标志物来预测患者RTOM/CTOM的风险，并且发现RTOM/CTOM的严重程度与其有较强的相关性。
    细胞周期蛋白抑制剂p16是一种细胞衰老的标志物，由损伤激活并导致细胞周期阻滞。有研究证明在放疗和辐射诱导的人皮肤标本、小鼠口腔溃疡和大鼠皮肤溃疡模型中p16的表达增加。因此认为p16可以通过反应细胞衰老来作为RTOM/CTOM的潜在标志物。在有关蛋白组学的研究中，检测到RTOM/CTOM患者唾液中3443m/z、3487m/z以及4135m/z蛋白峰值上升，而6237m/z蛋白峰值下降，进一步研究发现RTOM患者唾液中此四类蛋白组变化相同，而CTOM患者唾液中3443m/z、4135m/z蛋白峰值上升，3487m/z、6237m/z蛋白峰值下降，提示3443m/z、3487m/z、4135m/z和6237m/z是RTOM/CTOM潜在的生物标志物。
    7.总结
    RTOM/CTOM作为放疗化疗时口腔局部常见并发症，目前认为口腔黏膜炎有5个发病阶段：起始期、损伤反应期、信号放大期、溃疡期和愈合期，在不同阶段其生物标志物的含量水平不同。通过检测患者唾液、血液、组织中的生物标志物，可以及时掌握患者患RTOM/CTOM的风险是否增加，以期早期识别容易发展成严重RTOM/CTOM的患者，并有助于监测和表征这种不良反应，以及制定干预方案预防病情的恶化。
    各类生物标志物的生理意义不仅提示了RTOM/CTOM的发展，也为RTOM/CTOM的预防、治疗以及生物学评估提供了参考思路。然而，虽然目前研究发现有多种生物标志物可以用来预测RTOM/CTOM的风险或者早期识别容易发生严重RTOM/CTOM的患者，但是尚未有生物标志物用于临床，未来需要更多的研究对这些生物标志物的可靠性及准确性进行验证。