唾液检测早期诊断口腔癌的研究进展

    口腔癌是最常见的头颈部恶性肿瘤之一，其中鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）约占90%。尽管外科手术、放化疗等治疗方式不断进步，OSCC的5年生存率徘徊在60%左右，未见显著提高，重要原因是2/3以上的患者在初诊时已届肿瘤晚期。
    唾液中含有多种与OSCC相关的生物标志物，与血浆的成分常具有平行性。高通量和高灵敏度检测方法的出现解决了唾液中生物标志物浓度较低的问题。唾液与口腔癌病变部位直接接触，癌瘤表面坏死的细胞可直接脱落进入口腔，肿瘤细胞分泌的外泌体或其他分子也可以通过主动、被动运输等途径渗入唾液，且唾液易于收集、无侵入性，可以实时动态监测疾病变化，从而使唾液检测成为高效的OSCC早期诊断的筛选工具。本文通过对PubMed、中国知网、万方数据库进行检索，收集近五年的研究性文献，聚焦循环肿瘤DNA、细胞外囊泡和循环肿瘤细胞，综述相关研究的最新进展。
    1.循环肿瘤DNA（circulating cell-free tumor DNA，ctDNA）
    游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）是指在生理细胞更新或特定病理状态下，凋亡、焦亡、坏死细胞或活细胞释放入循环中的DNA。正常状态下，cfDNA会被吞噬细胞降解。但在癌症患者中，此机制受损，导致cfDNA在体液中累积。由肿瘤细胞释放的DNA称ctDNA，可反映肿瘤DNA甲基化、点突变和微卫星改变等变化，与病变组织的遗传学改变相关。
    ctDNA在肿瘤转移中的作用还不明确。癌细胞的转化可能是正常细胞内化包含ctDNA的囊泡，或直接接受循环中由原发灶肿瘤细胞主动释放的ctDNA后形成的。因此，ctDNA很可能是肿瘤转移的媒介。ctDNA的水平可以反映肿瘤负荷、进行预后判断及监测肿瘤切除术后肿瘤是否有残留和复发。
    一般来说，ctDNA的水平与病变所处时期呈正相关，且随疾病进展而迅速增加，并在成功的治疗干预后降低。Desai等对比44例口腔癌、40例口腔癌前病变患者、40例无口腔病变吸烟者和40例不吸烟的健康对照者血浆的cfDNA水平，发现口腔癌组的总cfDNA水平更高，且总cfDNA水平与淋巴结转移（P＝0.001）和临床分期（P＝0.006）呈正相关。Mazurek等对200例头颈鳞癌患者血浆的总cfDNA水平进行测定，结果显示，与正常对照相比，肿瘤患者的cfDNA水平增加，口咽癌患者增加更为显著。
    Lin等的结果也支持了血清cfDNA水平越高，OSCC患者的预后越差这一观点。cfDNA的水平会受炎症、吸烟、免疫等多种因素影响，而ctDNA更具特异性。虽然ctDNA主要释放入血液，但可以通过唾液腺的超滤作用、局部病灶主动或被动运输等多种途径在唾液中富集。唾液中富含来自口腔肿瘤的DNA，而血清则富含来自其他部位肿瘤的DNA。因此，在口腔癌中，唾液ctDNA检测的敏感性高于血清。
    Wang等报告，口腔癌患者唾液中ctDNA的检出率为100%，高于其他部位的头颈鳞癌患者，且肿瘤复发患者的ctDNA改变先于影像学改变，这提示唾液ctDNA检测可用于口腔癌的早期诊断和肿瘤复发的监测。ctDNA不仅可作为肿瘤的生物标志物，也可以用于肿瘤异质性的鉴别。ctDNA携带的遗传学改变信息对口腔癌发生的分子机制的研究有重要意义。
    Schrock等[的研究结果显示，血清中ctDNA甲基化的检测可有效应用于头颈鳞癌的诊断和患者预后的评估。SHOX2和SPEPT9两个基因甲基化作为肿瘤的生物标志物已在649例头颈癌患者的前瞻性队列研究中得到验证，ctDNA的甲基化水平与淋巴结转移和死亡率有关，且在临床出现复发和转移前即可检测到ctDNA甲基化水平的升高。
    有学者报告，OSCC患者的肿瘤组织及血清中的ctDNA都存在着微卫星不稳定，且与肿瘤分期相关。ctDNA也被用于肿瘤的耐药性监测及肿瘤患者对治疗反应的连续监测。但ctDNA在癌前病变患者中的应用价值有待进一步研究。
    2.细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）
    EVs可以分为两类：一类是通过出芽直接从细胞膜脱落的微泡，包括直径约50nm至1μm的微囊泡、微粒和大囊泡；另一类是外泌体，大小约30~150nm，由多囊泡体与质膜融合时通过胞吐作用释放。在不少研究中，存在着外泌体和EVs名称混用的现象，而目前的分离纯化技术可以鉴定不同类型的囊泡，因此有学者建议使用囊泡亚型名称以示区分。
    研究表明，EVs通过表面配体与靶细胞受体的识别结合、内吞作用或与质膜融合释放内含物等方式，参与细胞间的信息交流，调节细胞生命活动，介导肿瘤微环境形成和上皮间质转化等过程，进而调控肿瘤发生、侵袭和转移。肿瘤来源的EVs还可以通过免疫抑制和免疫刺激信号与免疫细胞交流从而调控肿瘤的发展。
    有学者致力于研究EVs对肿瘤早期诊断的作用。EVs富含多种miRNA，通过直接与邻近细胞或经血液循环与远处细胞信息交流调节肿瘤生长及侵袭。miRNA具有组织特异性，在不同肿瘤中表达不同，在不同来源的外泌体中表达也有差异。与口腔癌相关、表达上调的miRNA有miR-21，miR-455-5p，miR-155-5p，miR-372，miR-373，miR-29b，miR-1246，miR-196a和miR-181，而表达下调的miRNA有miR-204，miR-101，miR-32，miR-20a，miR-16，miR-17和miR-125b。
    Rabinowits等报告，外泌体中miRNA的表达模式比循环游离miRNA更贴近肿瘤组织中miRNA的表达，因此认为将外泌体中的miRNA作为生物标志物信度更高。通过检测唾液外泌体中差异表达的miRNA，可以实现对口腔癌的早期诊断。但是目前没有明确的、可用于临床检测的miRNA分子，对唾液来源的肿瘤外泌体的内含物的研究报道也较少。miR-21是研究较多的生物标志物，在OSCC患者的外泌体中表达增高。
    Li等的研究结果显示，低氧微环境可以刺激肿瘤细胞产生富含miR-21的外泌体，促进肿瘤细胞迁移。Liu和Chen等的研究均显示EVs介导的顺铂耐药性与miR-21有关。miR-21与促炎促肿瘤微环境的建立密不可分。Momen-Heravi等报告，单核细胞摄取富含miR-21的EVs后，激活NF-κB途径，增加白细胞介素-6、趋化因子CCL-2、基质金属蛋白酶-9等促炎因子的表达，从而促进炎症过程和肿瘤发展。
    陈莹的研究结果显示，OSCC患者血液和唾液来源的EVs中，miR-21-5p的表达趋势基本一致，呈正相关（R2＝0.6951），Pearson相关性为0.834（P＜0.05），且OSCC患者唾液EVs中miR-21-5p的表达水平在术后显著降低，可以用于预后判断。Dioguardi等对miR-21用于口腔癌的早期诊断进行了系统评价和荟萃分析，其灵敏度为0.771（95%CI0.680～0.842）（P＜0.001），而特异性为0.663（95%CI0.538～0.770）（P＜0.001），均显示了miR-21作为口腔癌诊断标志物和治疗靶点的可能性。
    Langevin等对体外培养的头颈鳞癌4种细胞系中分离出的外泌体进行了miRNA测序，筛选其中最广泛表达的miRNA并在患者唾液中进行验证。结果显示，miR-486-5p与miR-10b-5p在患者和健康对照组唾液的外泌体中存在差异表达，但敏感度较低。Gai等分析5例OSCC患者和5例健康对照者唾液外泌体的miRNA，发现miR-302b-3p和miR-517b-3p仅在OSCC患者中表达，而miR-512-3p和miR-412-3p在OSCC患者中呈现高表达。
    He等提出，唾液外泌体中miR-24-3p是OSCC潜在的新型肿瘤诊断生物标志物。此外，长非编码RNA在OSCC早期诊断中也有重要意义，但尚未见EVs中长非编码RNA与OSCC关系的报道。唾液中的微囊泡也可用于OSCC的早期诊断。Zhong等纯化并定量分析了65例OSCC患者唾液中的微囊泡，并以21例口腔溃疡患者和42例健康志愿者做对照。结果显示，OSCC患者唾液中的微囊泡水平显著升高，唾液微囊泡水平与OSCC患者的存活率呈负相关，提示其可能是OSCC恶性进展的标志物。
    3.循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）
    CTCs是由肿瘤原发灶或转移灶释放入血液循环中的细胞，携带多数与原发灶相同的突变谱，参与肿瘤自种植，极有可能是癌症转移的“先锋”。在癌症患者的血液中，CTCs可以有单细胞或细胞簇两种形式。CTCs细胞簇具有免疫逃逸的能力，可以更快地形成种植性肿瘤，在血液中存在的时间短而不易被检测到。
    Oliveira-Costa等研究OSCC患者的基因表达谱，在对CTCs的分析中观察到，PD-L1，HOXB9和ZNF813表达增高，BLNK的表达降低，这一结果与原发肿瘤的基因表达谱相符。多项研究结果表明，CTCs的水平与口腔癌患者生存率和治疗效果相关。对CTCs表面药物分子靶点的研究可能有助于精准免疫治疗药物的研发。
    CTCs主要根据其分子大小和生物学特性（表面的蛋白质标志物）而被分离出来，但与良性上皮细胞不易区分。在CTCs检测技术中，FDA批准在临床使用的是CellSearch系统，CTCs对上皮细胞黏附分子抗体及细胞角蛋白8，18和19呈阳性表达，CD45呈阴性表达，但此法可能会丢失CTCs细胞簇，导致血液中实际CTCs的总数偏低。
    无标记惯性微流体途径（label-free inertial microfluidics approach，LFIMA）克服了这一缺点。Kaoro等提出采用新一代测序技术结合LFTMA检测CTCs和ctDNA，结果显示，组合分析CTCs和ctDNA可以扩展液体活检所揭示的基因组谱变化的范围。Morgan等报告了一种新的方法，即表面增强拉曼光谱散射纳米技术，实现了CTCs的精准检测。CTCs检测虽然在肿瘤监测、分子靶向治疗、药敏实验等方面展现出良好的应用前景，但其精确性和对临床的指导作用有待提高。这依赖于精确的分析技术和生物信息学工具的利用。目前的研究多限于血样分析，唾液中是否存在主动释放的肿瘤细胞尚未可知。