水凝胶用于牙髓再生的研究进展

    牙髓再生是近年来牙髓病治疗研究的热点和难点。美国牙髓病学会将牙髓再生定义为“用生物手段，取代受损的牙体组织、牙根、牙髓-牙本质复合体等结构，形成有功能的牙髓样组织”。牙髓再生的研究主要利用组织工程学原理和手段，通过异体/自体/归巢干细胞-支架-生长因子复合体诱导分化出牙髓-牙本质复合体，修复受损牙髓组织并恢复其生理功能。其中，支架材料发挥着重要的桥梁作用。
    目前，支架材料不仅局限于为细胞种植、黏附、增殖和空间分布提供三维结构骨架，还起着发挥调控细胞行为和细胞内信号传递，模拟复原细胞生活微环境——细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的作用。水凝胶是在水中可以溶胀的高分子网络体系，它由单体经过交联反应形成，在结构和性能上具有不同于其他生物材料的特点。
    水凝胶形成的高分子网络能够束缚水分，高含水量使其具有良好的生物相容性。当水凝胶置于生物组织中时，其溶胀性使得水凝胶与组织的边界趋于模糊，表面张力降低，细胞和蛋白在其表面黏附减少，因此减少了异物反应。水凝胶与周围组织之间的摩擦力小，可以避免周围组织受损。水凝胶的三维网络结构和黏弹性与细胞外基质极为类似，可以模拟细胞生活的三维微环境，有利于细胞增殖和分化。目前水凝胶已用于皮肤、肝脏、血管、软骨、骨和肌肉组织再生的研究。
    在组织工程中，如何使细胞种植入支架后能在支架中均匀分布，以及如何将支架置入作用部位是其中的关键问题之一，这在牙髓再生中尤为重要。水凝胶可以制备成可注射剂型，在凝胶化前可通过注射的方式使液体充分填充髓腔和根管，然后再发生凝胶反应。这使得水凝胶与周围组织密切贴合，非常适合在牙髓再生研究中应用。
    水凝胶包封细胞后发生溶胶-凝胶转化，可使细胞在凝胶内部分布较为均匀，可能解决牙髓再生中外源细胞难以深入根管内支架深部的问题。由此可见，水凝胶材料在牙髓组织工程中有着其他材料不可比拟的优势。近年来水凝胶用于牙髓再生受到学者们关注，下面按照水凝胶组成分类，将其在牙髓再生领域研究进展进行综述。
    1.天然高分子水凝胶
    天然高分子水凝胶材料主要包括胶原/明胶、藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、纤维素等。其中，在牙髓再生领域应用的主要有胶原基水凝胶、壳聚糖基水凝胶和透明质酸基水凝胶。藻酸盐材料由于其不利于细胞黏附，较少作为单组分水凝胶用于牙髓再生的研究，常作为复合水凝胶的材料成分之一，与其他高分子共同发挥功能。
    1.1 胶原基水凝胶
    胶原基水凝胶是最广泛应用于牙髓组织工程的水凝胶支架材料。胶原能够被细胞识别，并能被细胞所分泌的蛋白酶降解，因此具有很好的生物学特性。在一定条件下，胶原分子能自发形成胶原纤维，并在水性溶剂中形成水凝胶。然而，单一成分的胶原基水凝胶的物理性能不理想，在含水时难以塑形，无法支撑组织重建。此外，天然胶原常来源于异种生物，因此容易导致免疫反应。
    近年来出现了安全性较高的人重组胶原支架，它与人体组织内的Ⅰ型胶原具有相同的氨基酸序列，明显减轻了排斥反应。Rosa等将脱落乳牙牙髓干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED） 和人重组胶原水凝胶混合注入发育完全的人牙根管中，发现SHED能存活且分化为成牙本质样细胞。
    胶原基水凝胶可制备为可注射水凝胶，如Yuan等制备了以Ⅰ型胶原与Ⅱ型胶原为主要成分的可注射胶原基水凝胶。Suzuki等发现，结合趋化因子的Ⅰ型鼠尾胶原基水凝胶也可作为细胞归巢的支架，但应用时存在体内缩水及降解过快等不足。如何在提高胶原稳定性的同时保持胶原活性，是今后胶原基水凝胶材料需要解决的难题。
    1.2 透明质酸基水凝胶
    透明质酸是一种构成细胞外基质的蛋白多糖，其共价交联形成的水凝胶具有良好的生物相容性。在透明质酸基水凝胶中添加基质金属蛋白酶的酶切位点，使其具有了良好的降解性能。但单一成分的透明质酸基水凝胶的机械性能较差，需要通过复合其他组分或化学修饰以改善性能。2009年，有学者研发了酪胺化的透明质酸基水凝胶CorgelTM。这种水凝胶在添加过氧化氢引发剂后发生凝胶化，并且能在一定程度上抵抗透明质酸酶消化，维持相对稳定性。
    Lambricht等比较了2种海藻酸盐基水凝胶和CorgelTM对根尖牙乳头干细胞（stem cell from apical papilla，SCAP）的影响，发现SCAP在这种透明质酸基水凝胶中能够维持增殖活性和向成牙本质样细胞分化。另一种商品化透明质酸基水凝胶RestylaneTM含有甘油醚交联剂（butanediol diglycidyl ether，BDDE），目前作为填充剂已广泛应用于医疗美容，与人体相容性好， 具有原位可注射性且可吸收。Chrepa等发现，RestylaneTM作为支架材料在体外能促进人牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs） 成牙本质向分化。目前未见其应用于动物体内牙髓再生的研究报道。
    1.3 壳聚糖基水凝胶
    壳聚糖是天然多糖甲壳素的脱乙酰产物，可以通过物理缔合（如结合阴离子、聚电解质、添加聚合物等） 或交联（化学交联、互穿网络） 形成壳聚糖基水凝胶，并可以精确地获得需要的孔径大小、交联程度和溶解度。壳聚糖基水凝胶由于其良好的生物相容性、生物降解性和天然抗菌作用，还可作为多种药物的缓释/控释载体，在生物医学领域得到了深入的研究和应用。
    研究显示，壳聚糖基水凝胶构成的地塞米松释放系统可以调节药物释放的速率，不同程度地促进SCAP的增殖和分化。在牙髓组织工程中，Park等研发了壳聚糖基的热响应型水凝胶，体外研究显示这种水凝胶联合使用釉质基质衍生物能够促进DPSCs的增殖和分化。多项研究均表明，壳聚糖对于牙源性干细胞的增殖和分化有良好的促进作用。壳聚糖基水凝胶可通过改性实现在体内的可注射性和原位凝胶化，具有可注射型支架的应用前景。但是，单一组分的壳聚糖基水凝胶也有与其他天然高分子水凝胶相似的弱点，即机械强度差。此外，壳聚糖在体内的降解机制尚未明确，体内降解过程较难调控。
    1.4 纤维素基水凝胶
    纤维素的纳米晶体（cellulose nanocrystals，CNC）因其具备一定的刚性和机械强度，常作为复合水凝胶中的填料掺入水凝胶网络中。但是，它们“缠结”的能力有限，不适用于构建单组分凝胶。纤维素纳米原纤维（cellulose nanofibrils，CNF） 具有更好的柔韧性和缠结倾向，更易形成水凝胶。
    有学者发现，CNF水凝胶作为细胞培养支架具有细胞毒性小且能诱导细胞球状体形成的优点。然而，单一成分的纤维素基水凝胶机械性能相对较弱，且缺乏宏观结构或层次结构，限制了其作为仿生水凝胶的进一步应用。目前尚无纤维素单组份水凝胶用于牙髓再生的研究报道。体外研究发现，DPSCs在羧甲基纤维素-羟磷灰石水凝胶中具有良好的成骨向分化和成牙向分化能力。
    1.5 藻酸盐基水凝胶
    藻酸盐基水凝胶作为1种天然的生物材料，具有良好的生物相容性并且易于凝胶化，在伤口愈合、载药和组织工程中广泛应用。由于缺乏哺乳动物细胞黏附受体和对蛋白质的低吸附性，藻酸盐基水凝胶可以作为一个理想的“空白支架”，允许多种方式修饰，从而改善其性能。在精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）黏附配体修饰的藻酸盐溶液中，细胞可以形成均匀的分散体。该体系通过特定的受体-配体相互作用生成交联的网络结构，无需使用任何其他的交联分子。
    有研究发现，与未添加黏附配体的藻酸盐基水凝胶相比，RGD-藻酸盐基水凝胶使细胞黏附和增殖能力显著增强。在牙髓再生方面，RGD-藻酸盐基水凝胶包载了血管内皮生长因子和成纤维生长因子后，能促进DPSCs/人脐静脉上皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs） 的黏附、增殖和分化。但是，藻酸盐的纯度差异可能会引起细胞的免疫反应，目前仍需要更加标准化的方法去除藻酸盐中的杂质成分。
    2.发展中的合成高分子水凝胶
    合成高分子水凝胶通常具有规则的结构，并且可设计修饰某些功能基团，从而实现功能调控。在组织工程中研究较多的聚合物主要有聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、聚乙醇酸（polyglycolide acid，PGA）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚己酸内酯（polycaprolactone，PCL）和多肽聚合物等。
    除多肽聚合物外，其余聚合物均为惰性材料，无生物活性，且其降解产物多为酸性，从而造成局部环境的改变，难以作为单一成分的水凝胶支架用于牙髓组织工程。因此，这些惰性聚合物多与明胶/胶原/壳聚糖等交联形成复合水凝胶用于牙髓再生的研究。Galler等将可注射PEG-纤维蛋白水凝胶用于牙髓再生的体内实验研究，获得了血管化的类牙髓样结缔组织。
    目前，由多肽聚合物在低浓度溶液中自组装成的具有纤维结构的多肽（self-assembling peptide，SAP） 水凝胶已成为研究热点之一。在组织工程应用中，SAP水凝胶具有良好生物相容性和可降解性，能构建纳米级支架和缓释系统，可设计功能性的氨基酸序列以满足不同类型细胞的生长需要。改变多肽浓度能使水凝胶的硬度和粘度发生变化，从而改变水凝胶的可塑性。
    Puramatrix水凝胶是一种商品化的可注射型SAP水凝胶。Dissanayaka等用PuraMatrix同时包载HUVECs和DPSCs进行动物体内实验，观察到形成了丰富的血管网。但是SAP水凝胶的制备工艺复杂，成本较高，获取途径有限，这对SAP水凝胶的推广应用有一定的限制。
    3.以天然水凝胶为主要成分的复合水凝胶
    天然水凝胶能维持较高的细胞存活率，而合成水凝胶能更好地控制其物理和机械性质，不同凝胶组分在交联过程中形成的互穿网络结构也会改变凝胶的理化性能。因此，以天然水凝胶为主要成分的复合水凝胶逐渐成为研究趋势。复合水凝胶有2种形式：共聚物水凝胶和互穿网络聚合物（interpenetrating polymer network，IPN） 水凝胶。共聚物水凝胶是由两种或多种不同的单体沿着聚合物网络的链以不规则、嵌段或交替构型排列形成，而IPN水凝胶是由两种合成和/或天然聚合物成分分别独立交联形成的网络结构。
    研究报道，藻酸盐与胶原复合水凝胶的机械性能增强，且能维持较好的生物相容性和细胞均匀分布特性。藻酸盐质量分数在0.5%~1%范围内能使复合水凝胶具有较好的弹性模量和适宜的刚性，使得DPSCs能在生长因子诱导下增殖和分化。Ravindran等发现ECM-胶原-壳聚糖复合支架可以诱导DPSCs向成牙本质方向分化，并在动物体内实验中观察到血管形成。
    目前，可注射的复合水凝胶在牙髓组织工程中具有良好的应用前景。可注射的甲基丙烯酸酯明胶（gelatin methacryloyl，GelMA） 水凝胶用于DPSCs/HUVECs的培养，可促进细胞的黏附和增殖，同时促进血管的新生。研究显示，由聚乙二醇二丙烯酸酯-透明质酸-明胶合成的可注射复合水凝胶HyStem-C对DPSCs具有良好的相容性，DPSCs可在其中迁移、生存和增殖。但是在牙髓组织工程中，目前仅有少量特定组分的复合水凝胶进行了体外或动物体内研究，尚无临床研究报告。
    此外，尚缺乏不同复合水凝胶应用于牙髓组织再生的对比研究。综上所述，在牙髓再生研究领域中，理想的水凝胶支架材料不仅应具有优异的生物学性能，可以模拟ECM，参与释放信号分子，调控干细胞的行为，还应具有优良的理化性能，包括适宜的强度、合适的孔隙率、与组织新生速率相匹配的降解速率，以及可原位注射适应根管形态的特性。从成分上来说，胶原、壳聚糖和透明质酸是经典且具有良好生物学特性的凝胶组分，多肽水凝胶目前处于前沿研究热点。
    牙髓再生支架研究应进一步在不同组分、性质和功能的水凝胶中筛选具备根管内应用特性，即可注射且在温和条件下原位成形的支架材料。然而，如何借助支架材料的发展，完成从实验室到临床的转化，实现真正的牙髓再生，仍需要进一步的探索。