3D干细胞培养在牙髓再生研究中的应用

    健康的牙髓组织是牙齿的营养来源和牙源性干细胞的栖息地，当受到外界刺激时，牙髓组织可能会发生不可逆的炎症甚至坏死。临床上常规的治疗方法是根管治疗，但牙齿会失去血供，无法感知外界刺激，容易变脆发生折裂，而牙髓再生能使牙根继续发育，有效预防根折。
    干细胞是牙髓再生的种子细胞，干细胞多能性的维持和质量对于牙髓再生至关重要，但在植入根管之前，普遍采用传统的2D培养方式，细胞内基因表达受限，部分生物学功能缺失且难以大规模扩增，不利于发挥牙髓再生的疗效和临床转化。三维（three-dimensional，3D）细胞培养是一种模拟人体内细胞生长环境的体外培养方式，使细胞保持原有的立体形态，有利于细胞内基因的表达和信号转导，可增强干细胞的活性与特异性分化的能力，改善血管和神经的生成，弥补传统的二维（two dimensional，2D）细胞培养的缺陷。
    目前，已有部分学者将3D细胞培养应用于牙髓再生研究中，发现其再生效果明显优于2D单层培养。因此，本文综述3D细胞培养的研究现状，分析3D干细胞培养在牙髓再生中的作用和应用，并对3D干细胞培养在牙髓再生中的潜在价值和挑战进行展望，为功能性神经血管化牙髓组织的再生提供理论依据。
    1. 3D细胞培养
    1.1 3D细胞培养的优点
    传统的细胞培养是在2D培养皿中进行的，细胞只能沿平面生长，不能充分伸展，使细胞原有形态发生改变，产生应力并传递至细胞核，影响细胞核内基因的表达，因此，需要一种改善细胞质量的培养方式。早在1912年Carrel等用3D培养的方式延长了活体组织在体外存活的寿命，发现心脏碎片可在体外长期存活并有节奏地跳动。
    随后，Emerman等将腺上皮细胞在3D胶原培养基中培养1个月，发现细胞形态依然完好，且具备良好的分化能力，自此3D细胞培养开始引起学者们的关注。直到2013年Lancaster等在《Nature》上提出3D干细胞类器官培养系统，成功建立了人脑体外模型，3D细胞培养取得了突破性的进展。相比于2D培养，干细胞3D培养可增加多能性标志物Nanog、Sox2和Oct4基因的表达，激活ERK/AKT信号通路，促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的分泌，神经细胞经3D培养后，为神经元的形成提供三维空间，有利于研究复杂脑内环境中的神经血管系统。因此，3D培养的细胞更符合体内细胞的基因型与信号转导模式，可模拟复杂和动态的体内实验，有望实现更多组织、器官和疾病模型的体外建立。
    1.2 3D细胞培养的方式
    1.2.1 支架培养
    通常由聚合物构成多孔或纤维状结构，是细胞3D培养较为传统的方式，常用的材料包括:水凝胶、胶原纤维和脱细胞支架等。水凝胶因其疏松的三维结构，通常被用作人造细胞外基质来模拟生理环境和细胞与基质的相互作用，在调节细胞分化、扩散和增殖等行为中起着关键作用，常用的Matrigel水凝胶支架富含层粘连蛋白和Ⅳ型胶原，可为细胞提供与人体相似的三维培养环境，有利于诱导细胞分化。
    胶原纤维支架可使胚胎干细胞保持干性，有利于运动神经元的形成和分化，为细胞粘附、迁移和在3D网络中的生长提供稳定的基质。脱细胞支架通过去除组织和器官内原有的细胞后接种干细胞，对细胞成分进行重组，使其保留细胞外基质蛋白的自然结构，是3D培养理想的培养基，且很少引起免疫排斥反应。
    1.2.2 无支架培养
    利用细胞聚集性趋势形成聚集体或三维微球，通过悬滴技术、球形培养皿或者旋转器械进行细胞培养，这种方式较为简单且不含支架结构，可避免支架降解能力差和影响细胞生长的缺点。Li等用玻璃球形培养皿配合摇杆培养人脐带间充质干细胞，诱导细胞成球，将球体的直径控制在200μm 左右，发现在球体的外部和中心都有活跃增殖的干细胞，呈典型的克隆状生长，干细胞特异性标志物c-myc和Klf-4水平较高，具有良好的分化效率和自我更新能力。
    Murata等将脂肪间充质干细胞球体转移到圆柱形模具中培养，可形成无支架3D干细胞聚集体，植入到小型猪关节缺损模型中，可促进骨和软骨组织的再生。此外，3D间充质干细胞微球还可通过激活Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路促进成骨。
    1.3 3D细胞培养的应用
    1.3.1 疾病模型的建立与药物的筛选
    由于传统的2D细胞培养系统在模拟复杂和动态的3D脑环境方面受到限制，Kim等利用基于Matrigel的3D培养系统培养人类神经祖细胞，发现3D培养系统可加速β-淀粉样蛋白（amyloid-beta peptides，Aβ）的沉积，通过微管相关蛋白质tau蛋白的磷酸化，促进神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT），能更好地模拟阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）患者的脑结构，为高通量药物筛选提供平台。在癌症研究中，3D体外肿瘤细胞模型可简单有效地复制肿瘤生长微环境，使其对化疗药物产生更强的抵抗，显示出与人体相似的耐药模式，可更精准地在体外筛选新的抗癌药物。
    1.3.2 组织的再生
    间充质干细胞经3D培养后，成骨分化相关因子、血管生成以及干细胞标志性相关因子的表达明显高于2D培养，再生能力更强。胚胎干细胞和内皮细胞经3D共培养后，可改善神经元轴突的生长，增加神经元的活性和分化能力。骨骼肌细胞与成骨细胞进行3D共培养，可建立完整的体外3D肌肉骨骼连接模型。
    1.3.3 器官的体外培养
    肝细胞经3D培养，有望在体外建立肝病模型和人工肝。心脏碎片通过3D细胞培养，可在体外存活至少3个月并且有节奏的跳动。多能干细胞3D 聚集体可构建大脑模型，有利于在体外监测人脑的发育和功能，研究神经障碍性疾病的机制。未来能否在体外建立人工牙髓和牙髓疾病模型，还有待开展。
    2.3D干细胞培养在牙髓再生研究中的优势
    2.1 优化牙髓再生的方法
    根据有无外源性干细胞的植入可以将牙髓再生分为内源性细胞归巢和外源性干细胞移植两大类。内源性细胞归巢是指通过植入支架和生长因子吸引自身干细胞迁移至根管内，但当牙髓组织发生炎症或坏死时，会留下6~9mm长的锥形管腔，超过了内源性干细胞迁移、增殖和再生组织的临界大小，无法充分形成新的分布于根管全长的牙髓样组织。
    因此，需要植入外源性干细胞以实现牙髓充分再生，通常是将体外2D培养的干细胞结合支架和生长因子植入根管内，虽然支架材料可为干细胞提供适宜的三维生长环境，但干细胞结合支架植入根管之前，仍普遍在2D培养瓶或皿中生长，干细胞多能性与分化能力受损，无法大规模扩增，影响体内牙髓再生的效果，甚至出现细胞实验和体内实验结果不一致的现象。3D干细胞培养可弥补上述弊端，为牙本质、血管和神经的再生提供适宜的三维环境，优化牙髓再生效果。
    2.2 增强干细胞再生的能力
    2.2.1 维持细胞的干性
    牙源性干细胞是牙髓再生的基础，通过增殖、迁移、成血管、成神经和成牙本质分化实现牙髓再生。在传统的2D 培养模式下，干细胞多能性会降低，从而影响干细胞的质量。而经过3D 培养的牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）与贴壁的单层细胞相比，表达更高水平的干细胞标记物Nanog和Oct4，且多向分化的主要调节因子，如骨/牙形成调节因子RUNT相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）和脂肪生成调节因子过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors γ，PPARγ）表达水平升高，显示出更强的多能性，可为牙髓组织再生效果的优化提供潜在的机会。
    2.2.2 改善牙本质的形成
    3D培养和2D单层培养的DPSCs基因表达有显著差异，3DDPSCs具有更强的矿化能力和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，成牙本质标志蛋白牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、成骨分化标志物骨钙素（osteocalcin，OCN）和Ⅰ型胶原（typeⅠcollagen，COL1A）的表达增加，有利于牙本质的形成和牙根继续发育。
    2.2.3 促进血管神经的再生
    血管和神经的形成可以为干细胞提供营养和感知外界刺激，在3D培养条件下，促血管生成相关因子表达增高，血管生成增多。Zhang等发现3DDPSCs可以促进人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelialcells，HUVECs）的出芽，并通过Ang1/Tie2 和VEGF/VEGFR2信号通路维持3D 共培养球体模型中血管的稳定性。
    Chen等将小鼠的根尖牙乳头间充质干细胞（stem cells from apical papilla，SCAPs）进行3D培养，经转录因子Sp7形成CD24a阳性表达的多能干细胞3D微球，比原代和单层培养的SCAPs有更强的成骨和成牙分化能力，将上述3种细胞分别结合Matrigel水凝胶和牙本质基质模拟根管内三维环境，植入裸鼠背部皮下进行比较，发现3DSCAPs微球组血管特异性标志物VEGF、CD31和神经标记因子胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、S100、NF200的表达呈强阳性，可再生含神经血管样组织的牙髓-牙本质复合体，而植入原代和单层培养的SCAPs则未出现类似结果，说明细胞前期培养方式的差异，不仅会影响体外实验的结果，还会显著影响体内实验中组织再生的效果。
    3. 3D干细胞培养在牙髓再生研究中应用
    3.1 应用的形式
    3.1.1 有支架的3D培养
    Itoh等成功用温度响应水凝胶构建3DDPSC细胞棒状水凝胶聚集体，发现3DDPSC外层ALP和DSPP的表达明显升高，内层细胞自我更新关键因子Nanog的表达高于外层，外层的DPSCs分化为成牙本质细胞，而内层DPSCs保持干性。动物实验表明，3DDPSC可形成血管和纤维样组织，通过计算机辅助制备各种大小和形状的3DDPSC水凝胶聚集体，可为实现个性化的牙髓再生治疗提供理论依据。
    Yang等采用静电微滴法制备hDPSC牙髓再生水凝胶微球，发现3D水凝胶微球在体外具有较好的生物活性和低温保存性，复苏后植入体内可以形成牙髓和牙本质样组织，为牙髓再生提供优质的干细胞来源。Zhang等通过藻酸盐和纳米硅酸盐锂皂石水凝胶微球包裹hDPSCs和VEGF，发现hDPSCs均匀分布在水凝胶微球中，细胞存活率超过85%，VEGF可缓慢持续释放，植入体内可促进牙髓样组织和微血管的形成。水凝胶3D细胞微球可模拟人体微环境，具有可注射性，便于进入细小根管，可作为牙髓再生干细胞输送的载体。
    3.1.2 无支架的3D培养
    3D培养系统可以促进细胞间的相互作用自发形成聚集体或产生细胞微球，通常比2D单层培养的干细胞显示出更好的再生潜力，还可避免支架降解能力差，易造成牙髓炎症和感染的风险。Son等将DPSCs放入球形培养皿中，2h后可见DPSCs形成聚集体，24h后形成球体，72h后球体形态基本保持不变，3DDPSCs球体可增强多能性标志物Oct4、Sox2和Nanog的表达，改善DPSCs成骨和成脂分化的潜能。Chan等发现3DDPSCs球体通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路，使成骨、成脂、成血管和细胞干性相关基因和蛋白的表达显著高于3DDPSCs聚集体和2DDPSCs单层培养，说明3D球体培养优于3D聚集体和2D培养，可提升DPSCs的治疗效果。
    3.2 培养方法的改进
    虽然3D细胞培养在牙髓再生中的应用逐渐显现出优势，但是这种培养方式比较精细昂贵，且结果不可控，Yang等在3D培养环境中加入磁性纳米颗粒（magnetic nanoparticle，MNP）构建的磁体片，MNP可进入或结合DPSCs，通过操纵磁场聚集细胞，使DPSCs的3D结构不再受细胞类型的限制，形成3D球体，增殖和迁移能力增强，缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）和VEGF高表达，血管形成更多，可为血管化的微组织移植及再生提供理论依据，并且能够有效避免3D支架材料的免疫排异和降解困难。
    Salgado等利用多室支架旋转烧瓶动态3D培养DPSCs，改善营养和氧气的扩散，模拟人体内环境，避免3D细胞球体因缺氧导致中心坏死，与静态培养相比，干细胞的存活率和增殖率增高，成骨分化因子ALP、Runx2、骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）和骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的表达增加，有望用于骨组织工程学。
    4.总结与展望
    3D干细胞培养在组织和器官再生领域有较大前景，可在体外建立骨、肝、心和脑等组织和器官模型。在牙髓再生研究中，3D干细胞培养可为功能性牙髓组织再生提供生长状态最佳的干细胞，未来有望用其在体外培养牙髓组织和建立疾病模型。
    但3D干细胞培养仍然存在以下问题有待于研究和解决，一方面是由于培养方式精细，培养结果不可控，目前难以普及，需要进一步开发和简化培养方法，使培养效果更稳定；另一方面是观察手段较为复杂，需要高质量的成像技术、检测设备以及检测方法，以评估干细胞或者微组织的复杂形态和功能；此外，干细胞的来源、培养方式和保存条件涉及生物医学和伦理问题，同种异体干细胞的应用，干细胞的批量生产、冻存及复苏，是基础研究向临床转化需要攻克的难关。