壳聚糖促进口腔软组织修复的研究进展

    壳聚糖（chitosan，CS），又名脱乙酰甲壳素，是一种由β-（1，4）-2-乙酰氨基-D-葡萄糖和β-（1，4）-2-氨基-D-葡萄糖为单体组成的天然高分子聚合物，也是自然界中目前发现的唯一带有正电荷的碱性多糖，广泛存在于甲壳类动物、真菌的外骨骼中，年产量大约为一万亿吨。作为仅次于纤维素的第二大类天然高分子化合物，CS具有多种生物学性能，如优异的生物相容性、可靠的生物安全性和可降解性等，在骨组织工程、牙周组织工程、生物载体等领域得到了广泛的研究和应用。
    近年来，外伤、炎症、肿瘤等因素常常对口腔软组织造成不同程度的损伤，严重影响患者的张口、咀嚼、发音、吞咽等基本功能。带蒂瓣软组织技术、游离软组织移植术可在一定程度实现软组织重建，局限性在于增加新的创面且供区有限。因此，开发不同类型支架材料使之替代软组织移植成为当下研究热点。本文就CS促进口腔软组织修复的研究进展作一综述。
    1.CS的基本性质及对软组织修复的意义
    1.）抗菌性：作为天然抗菌剂，CS具有广谱抗菌作用，抗菌效果与CS的剂型、相对分子质量、脱乙酰度、温度、pH值以及微生物类型等因素有关。CS的抗菌作用与其所带的正电荷密切相关，氨基质子化的CS可与革兰阳性细菌表面带负电荷的磷壁酸发生静电作用，导致细胞表面通透性增加，细胞内物质渗漏，细菌形态明显变化，引起细胞死亡。
    此外，CS也可与革兰阴性细菌表面的脂多糖，真菌细胞表面的磷脂发生静电作用，达到抑菌效果。CS还可以通过干扰微生物DNA表达，螯合金属离子，形成致密聚合物薄膜阻止微生物营养物质交换等方式发挥抗菌作用。在软组织修复过程中，防止微生物感染是手术成功和愈后效果满意的关键。人类口腔生态系分布着许多正常菌丛，这种有菌环境增加了伤口感染的风险，伤口感染会造成软组织延迟愈合，甚至引发败血症导致病人死亡。CS作为理想的抗菌材料，可以减少伤口部位的致病菌数量，为受损组织提供稳定的修复环境。
    2）止血性：CS止血作用与其结构表面携带的高密度正电基团有关，人体中红细胞和血小板表面均带有不等量的负电荷，CS能够通过静电作用增强红细胞和血小板的黏附和聚集，进而形成血凝块封闭破裂血管，从而达到止血效果。
    众多学者发现，不同脱乙酰度CS均可促进红细胞和血小板的聚集。目前，研制的CS基止血材料已取得满意效果。Radwan-Praglowska等成功开发一种新型CS基止血剂，可促进红细胞在生物材料表面黏附，加速血凝块的形成。
    Yuan等开发的CS基纳米复合材料，对红细胞和血小板的黏附性更强，止血效果优于商用止血产品Surgicel纱布。止血是软组织修复过程的首要阶段，迅速控制出血能加速软组织修复从止血阶段向炎症反应阶段过渡，从而缩短治疗时间，提高软组织修复的愈合效率。
    3）促愈合性：CS是一种线状的天然碳水化合物，与细胞外基质的结构相似，细胞外基质在协调和引导细胞表型、黏附、迁移和增殖方面起着关键作用。CS表面具有游离的氨基和羟基等亲水基团，可以把组织液和细胞吸引到软组织损伤部位，促进细胞黏附、增殖和分化。
    基于自身良好的促愈合性能，CS可参与受损皮肤、黏膜等部位软组织修复的各个阶段，在皮肤烧伤、口腔黏膜缺损修复等领域有着广泛的研究。此外，Ducret等发现CS还可以在不改变牙髓细胞的活力、形态的前提下，促进牙髓组织再生。
    2.CS促进软组织修复的机制
    软组织修复是一个涉及多种细胞和细胞因子的复杂而连续的动态过程，包括止血、炎症反应、细胞增生和组织重塑四个阶段，正常软组织修复依赖角质形成细胞、内皮细胞、成纤维细胞、生长因子、炎症因子等的相互协调。在止血阶段，受损软组织发生反射性血管收缩，同时，活化凝血因子Ⅹ与Ca2+、PF3、AFV形成凝血酶原激活剂，受激活的凝血酶可以将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，从而凝聚红细胞和血小板。
    血小板的黏附、聚集与其表面特异性糖蛋白GPⅠa-Ⅱa、GPⅥ、GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ、GPⅡb-Ⅲa有关。Periayah等发现CS可增强血小板GPⅡb-Ⅲa的表达从而加速血小板的凝聚。Hou等发现CS纳米颗粒可增强血小板源性生长因子-BB的表达，对毛细血管周细胞的聚集起重要作用。当软组织修复进入炎症反应阶段，受损软组织中会产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。
    作为氧化应激诱导剂，少量ROS对软组织修复有益，大量ROS累积会导致伤口持续保持炎症状态，阻碍软组织愈合。ROS可激活核因子E2相关因子2（Nrf2）/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）信号转导通路，加强Nrf2及下游调控的抗氧化酶的表达，包括血红素氧合酶1、NAD（P）H醌氧化还原酶1和谷胱甘肽等。
    研究发现，低聚CS能够显著促进Nrf2和血红素氧合酶1的表达，通过激活抗氧化防御系统减轻氧化应激。Zhang等报道，壳寡糖通过激活p38和JNK-MAPK介导的Nrf2/ARE信号转导通路预防阿霉素诱导的氧化应激。细胞增生和组织重塑阶段以肉芽组织的形成、胶原蛋白沉积、广泛的再上皮化为特征。
    CS可以在生物体内酶的作用下降解生成CS单体，逐渐释放N-乙酰-D-葡萄糖胺，从而刺激软组织损伤区域成纤维细胞增殖与黏附，促进Ⅲ型胶原的产生，帮助胶原蛋白有序沉积，并刺激伤口部位天然透明质酸水平的提高，加速肉芽组织的形成，促进软组织再上皮化。此外，CS对软组织修复过程中相关生长因子、炎症因子的表达具有重要作用。
    据报道，CS能调节转化生长因子-β、血小板衍生生长因子和白介素-1等因子的分泌，这些细胞因子能够诱导巨噬细胞、成纤维细胞、血管胶质细胞等进一步发生级联反应，加速软组织修复过程。Venkataprasanna等利用CS制备的复合贴片可刺激多形核细胞和单核细胞的迁移，刺激嗜中性粒细胞和巨噬细胞吞噬并产生白细胞B4和白介素-1（IL-1），促进上皮再生。
    XU等研制了负载人脐带间充质干细胞的功能性可注射温敏性CS水凝胶，可增加胶原蛋白沉积和角质形成标志物K1的表达，抑制伤口过度炎症，加速软组织愈合。Chen等研制了基于乙二醇-CS的抗菌性冻凝胶，通过激活C3a和C5a，增加基质细胞衍生因子-1和转化生长因子-β1的分泌。
    3.CS在口腔软组织修复中的应用类型
    1）膜型：CS作为一种天然高分子化合物对口腔软组织的修复有着积极的作用。局部应用CS或其复合材料促进口腔软组织修复的试验目前正被国内外学者探讨和研究。Lotfi等使用蒸发溶剂和冷冻干燥法制备CS薄膜，在杂交犬双侧上颌尖牙、上颌第二前磨牙和下颌第二前磨牙牙龈区域建立口腔黏膜缺损模型。结果显示，CS薄膜组和负载牙龈成纤维细胞CS薄膜组均具有增加犬角化龈宽度的效果，且具有良好的生物安全性。
    Kolom等制备单纯CS薄膜和谷胱甘肽（GSH）：CS=1：1（w/w）的薄膜，在新西兰兔下颌门齿和磨牙之间建立宽度为15mm的黏膜缺损。研究发现单纯CS组和CS+GSH薄膜组均可以帮助软组织愈合，CS+GSH薄膜组的软组织中丙二醛（MDA）水平低于其他组。Choi等采用静电纺丝法制备了基于CS、EudragitoL（EL）的纳米纤维膜，结果证实了含有人生长激素（hGH）的基于CS、EL的纳米纤维膜对酸性口腔黏膜溃疡部位具有良好的软组织修复效果，0.5%CS/EL/hGH纤维膜能够使口腔黏膜溃疡完全愈合。另外，有学者专门报道了CS复合膜组织相容性的研究。张开润等运用冰浴超声破碎技术制成CS-氧化石墨烯复合膜，证明其有利于人牙龈成纤维细胞（HGF）增殖和黏附，具有良好的组织相容性。
    2）凝胶型：水凝胶比任何其他类型的合成聚合物材料更像天然软组织，这使得与细胞的黏附变得更容易，这些特性有助于维持细胞形态并促进细胞增殖。基于CS水凝胶拥有良好的生物学性能，凝胶型CS及其复合材料促进软组织修复的作用已被证实。Miranda等采用CS、改性透明质酸（HA）制备CS-HA复合水凝胶，AlamarBlue测试显示此水凝胶内细胞活力增强和CD44表达明显增加，证明该水凝胶良好的细胞相容性，可促进成纤维细胞黏附。
Huang等开发的羧甲基CS-醛改性碳纳米管可注射纳米复合自愈水凝胶，可完全覆盖损伤面积较大和不规则形状的创面，在软组织愈合中表现出更高的创面愈合率，创面胶原纤维密集且排列平行，创面瘢痕较少。Ji等首次将基于CS、聚谷氨酸（PG）的聚电解质复合物（PEC）水凝胶与羟基磷灰石（HA）复合作为真皮充填剂，体内实验表明，此真皮充填剂具有良好的生物相容性，可促进成纤维细胞分泌胶原蛋白。
    Jaikumar等研制的海藻酸钠/纳米纤维蛋白/O-羧甲基CS可注射性水凝胶弹性模量约2kPa，接近天然脂肪组织，并且支持人脂肪干细胞（hADSCs）黏附、增殖和分化，是软组织修复的理想材料。Luo等成功开发了一种CS基热凝胶，研究结果表明，该热凝胶在体外能抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，并促进牙龈成纤维细胞的增殖，有望成为治疗口腔黏膜溃疡的一种有前途的注射型治疗剂。
    3）海绵型：CS海绵是一种有效的止血敷料，具有相互连通的多孔结构、高溶胀能力、良好的抗菌活性和快速止血能力。Cheng等采用共价偶联和冷冻干燥法制备了羧甲基CS接枝胶原肽海绵（CMC-COP），皮肤烧伤实验发现，第7天可实现表皮再生，胶原纤维沉积，第14天表皮完全愈合，第21天创面完全愈合。
    Varoni等运用冷冻干燥法、电化学沉积法开发了一种基于CS的三层海绵状多孔支架，该支架不仅可以促进口腔牙龈组织修复，也可促进牙周骨骼和牙周韧带的再生，具有很高的生物相容性。研究发现，负载姜黄素或PRP-Exos的CS/丝素水凝胶海绵，在修复糖尿病小鼠皮肤软组织损伤中发挥良好的作用。无论单独或联合治疗均显著加速了糖尿病大鼠伤口的收缩、再上皮化、胶原合成和沉积，以及真皮血管的生成，从而使糖尿病伤口更快的愈合。
    Hu等将羟丁基CS与CS物理混合，通过真空冷冻干燥形成多孔复合海绵，复合海绵的保水性和红细胞聚集性分别优于CS海绵和羟丁基CS海绵，大鼠创面愈合实验表明，与CS海绵和羟丁基CS海绵相比，复合海绵能支持上皮细胞的爬行生长，促进创面愈合。
    海绵的三维多孔结构具有较高的吸水率和稳定性，有利于保存软组织所需的营养物质和保持伤口湿润，从而促进上皮细胞在复合海绵中的爬行生长，加速伤口愈合。4.其他：近年来，一些学者尝试开发新型CS复合物。Park等研究发现，经水溶性甲壳素（WSC）处理人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）植入小鼠体内后，能够显著增加胶原蛋白、透明质酸合成酶和赖氨酰氧化酶家族的表达。据Kalyoncuoglu等报道，HGF在CS包被的Al2O3和ZrO2表面具有良好的黏附和增殖作用。
    当下，CS常被制成膜型、凝胶型、海绵型复合材料应用于受损软组织修复的研究，有望作为新型软组织修复材料，解决天然牙、种植修复义齿周围软组织轮廓缺损、角化龈不足、邻间隙龈乳头丧失等临床问题，代替传统的软组织移植术。此外，基于良好的止血性、抗菌性、促愈合性，CS有望在治疗口腔黏膜溃疡疾病方面发挥重要作用。
    综上所述，CS因其丰富的生物学性能，不仅可以与众多材料复合被加工成不同类型，也能够携带种子细胞、生长因子，作为生物支架协同促进软组织修复。然而，关于CS促进口腔软组织修复的研究尚有不足。①研究尚处于起步阶段，细胞研究以HGF、hBMSCs为主，CS对牙龈上皮细胞、龈沟上皮细胞、结合上皮细胞的影响未见报道。②动物实验以研究皮肤损伤居多，缺乏口腔内软组织缺损动物模型。③关于口腔软组织缺损模型的建立，国内尚无统一标准。④不同类型的CS复合材料在软组织修复中的作用机制仍需进一步研究。