牙髓再生支架材料的研究进展

    牙髓再生这一概念已经存在了几十年。1971年，Nygaard-Östby和Hjortdal提出了再生牙髓组织的概念。牙髓再生治疗的定义为：利用组织工程学原理，以健康的新生牙髓取代已感染或坏死的牙髓组织，从而恢复正常的牙髓-牙本质复合体的结构和功能的治疗手段。
作为治疗年轻恒牙牙髓坏死的新技术，牙髓再生治疗可使未发育完全的根尖孔闭合，根管壁增厚，牙根增长，较好地保存牙齿的生理功能。再生技术的3个关键要素是干细胞、支架和信号分子。
    牙髓再生的支架材料应具备以下能力：为干细胞提供生物学和机械支持，创造允许细胞黏附、迁移、增殖和分化的环境，可降解且降解速率与组织形成速率一致，无毒害和易制取等。目前牙髓再生的支架可以大致分为生物提取和人工合成两大类。
    生物提取的支架包括血凝块（blood clot，BC）、富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）、富血小板纤维蛋白（platelet rich fibrin，PRF）、透明质酸、藻酸盐、壳聚糖（chitosan，CS）、胶原、丝、脱细胞细胞外基质（extracellular matrix，ECM）等；人工合成的支架包括聚合物、生物陶瓷等；此外，还有将两种或两种以上材料结合在一起的复合支架。本文就这些支架材料的性能和应用前景的研究进展作一综述。
    1.生物提取的支架
    从生物资源里提取的基质一般具有较好的生物相容性和生物活性，但其降解速率和微观结构不易调控，还有免疫原性和毒性方面的顾虑。
    1.1BC
    BC是目前牙髓再生治疗中最传统最普及的一种支架材料。BC不仅是支架，还是引入干细胞的主要手段。通过刺破根尖周组织使血液进入根管，可简便直接地获得BC。牙髓再生治疗应用单纯BC支架后，人牙根发育的成功率为53.3%~100%。BC具有高成功率、简便易行、经济性和天然无害的特点，但其效果存在争议。
    Altaii等通过动物实验比较了BC支架、PRP、胶原支架进行牙髓血运重建治疗的效果，发现BC支架较其他支架形成硬组织的概率低。BC仍有很多不足，首先BC不能诱导真正的牙髓牙本质复合体再生，其次BC的结构脆弱，治疗时可能不能获得足量的BC以充盈根管，从而导致上方封闭塌陷。学者们目前仍在研究其他新型材料作为支架，以期获得真正的牙髓再生。
    1.2PRP和PRF
    PRP是一种具有丰富生长因子的自体第1代血小板浓缩物，可以说是不同生长因子的浓缩悬浮液。PRP可通过自体血液加工后获得，无免疫原性和传播疾病的风险。Jadhav等对20例患者的年轻恒前牙进行牙髓血运重建治疗，随访12个月，结果发现：与不应用PRP相比较，应用PRP的患牙在根尖周愈合、根尖孔闭合和根管壁增厚的程度方面均有明显增加，而牙根长度增加方面则无明显差异。
    分析可能的机制为：在局部应用PRP时，血小板数量增加高达338%，血小板数量增加会导致由它们分泌的生长因子数量增加；PRP中的血小板被激活后，其α脱颗粒可产生高浓度生长因子，各种生长因子之间会相互影响和作用，通过自分泌或旁分泌模式刺激周围细胞再聚集，并调节细胞的趋化、迁移、增殖和分化，从而引发及时有效的组织修复过程。然而，Alagl等使用PRP和BC进行牙髓血运重建的临床对照研究则表明除了根长显著增加之外，PRP处理的结果与BC没有明显差异。
    Bezgin等的研究也表明：使用PRP与BC在牙根发育和炎症反应等方面的效果均没有明显差异。上述研究提示PRP支架的功能具有不确定性，目前仍不能认为PRP可取代BC获得更好的牙根发育效果。除此之外，使用PRP支架的缺点有：需要患者抽血，需要特殊设备和试剂来制备，以及增加治疗成本等。
    PRF是具有高浓度的纤维蛋白凝块的第2代血小板浓缩物。与PRP相比，PRF在制备过程中不需要补充凝血酶，含有更高浓度的细胞因子，且释放生长因子速度更为缓慢，更有利于碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）表达和矿化诱导。
    目前PRF应用于临床牙髓再生治疗成功的案例报道仅有数例。Ulusoy等认为：PRF可以获得与PRP、BC类似的临床和放射学结果。李文静等认为：PRF有优秀的生物诱导性，能较好地保存牙髓活力，诱导年轻恒牙牙根形成，提高治疗成功率。目前尚需更多的研究来验证其作为牙髓再生支架的效果。
    1.3多糖
    多糖类支架也常用于牙髓再生。多糖类材料包括透明质酸、藻酸盐、CS和VitroGel3D多糖水凝胶等。透明质酸是存在于ECM中的糖胺聚糖之一，通过保留细胞外间隙在维持组织形态中起重要作用。
    藻酸盐是从褐藻中分离出的一类多糖。CS是甲壳素脱乙酰化产生的，甲壳素是甲壳类（如螃蟹和虾）的外骨骼和真菌细胞壁的结构元素。CS具有多种生物学特性，如抗菌性、生物相容性、生物降解性、止血能力、与蛋白质显著的亲和力和促进细胞黏附、增殖和分化的能力，易被加工成各种结构，具有作为牙髓再生支架的潜力。
    这些材料都具有生物相容性和无毒性，但机械强度低，体内降解速度不受控制。2014年，Lambricht等和Martin等通过体外和体内实验评估了各种类型和组成的透明质酸和藻酸盐天然水凝胶，发现它们能够促进根尖牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla，SCAPs）增殖、矿化和分化为成牙本质细胞表型。这提示多糖类支架具有可用于牙髓再生的潜力。透明质酸可制成可注射凝胶或透明质酸海绵。
    Ferroni等将牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）接种到透明质酸支架上，发现透明质酸可诱导成骨或成牙髓样组织。藻酸盐可通过增加钙含量和交联密度改善机械强度。携带转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的藻酸盐水凝胶可在体外诱导人成牙本质细胞样细胞分化并产生规则的管状牙本质基质。
    Verma等对20只雪貂尖牙使用DPSCs+藻酸盐水凝胶或者BC支架进行牙髓再生治疗，发现两者对牙根发育效果并无明显差异。Palma等使用BC和2种不同配方的CS水凝胶作为支架进行犬的牙髓再生治疗，发现CS支架不能改善根管内矿化组织的形成，也不能促进牙髓牙本质复合体再生，与单独使用BC支架相比更易导致炎症反应，降解时间过长。
    而曹春玲等研究了人牙髓细胞在可注射羟乙基壳聚糖基水凝胶内的增殖和分化状况，发现在成牙本质向诱导培养14d后，牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、牙本质基质蛋白（dentin matrixprotein，DMP）-1、ALP表达水平较高，展现了良好的成牙本质向分化潜力和矿化潜力。
    Xiao等认为：已经商品化的非动物源的VitroGel3D合成多糖水凝胶有作为牙髓再生支架的潜力。该研究在VitroGel3D合成多糖水凝胶中培养SCAPs，发现与传统的2D单层细胞培养相比，3D水凝胶系统中SCAPs生长的形态和行为与自然生长状态非常相似，并且混入的基质细胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）能够协同骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2，促进DMP-1和DSPP表达明显增加，增加血管化水平和成骨水平。
    1.4胶原
    胶原是一种天然蛋白质，是ECM的主要成分，可从动物的皮肤、骨骼、韧带等组织中提取，来源广泛且种类繁多。目前已鉴定的胶原就有19种，而支架材料主要由Ⅰ型胶原制备。胶原可加工成各种形式，包括多孔海绵、凝胶和膜，并可与化学物质交联以改变其降解速率和收缩率。
    1.4.1胶原膜
    在临床上牙髓再生治疗时，如果不能获得足够的血液作为支架，密封材料易塌陷，使用可吸收胶原膜能防止密封材料塌陷，在血液不足的情况下作为支架允许新的组织生长进入髓腔。Bio-Gide是一种可吸收的纯胶原膜，广泛用作牙周组织再生的支架材料。
    Jiang等和Fahmy等通过临床研究发现：是否使用胶原膜在治疗成功率和其他临床指标方面没有明显差异，牙根继续发育参数，如根长、根尖1/3牙本质壁厚度、根尖孔宽度并没有明显差异，但能够促进牙根中1/3牙本质形成，这有利于避免根折。胶原膜还增加了操作的便利性，并可确保密封材料的定位，特别适用于根管粗大的牙齿。
    1.4.2明胶海绵
    有学者对犬的根尖周炎年轻恒牙进行牙髓血运重建，结果与仅使用BC相比，明胶海绵和BC作为组合支架使用时能够形成更多的新生组织。Yamauchi等进行了类似的研究，同样发现使用交联的胶原蛋白支架增加了管腔中的矿化组织形成。
    1.4.3胶原水凝胶
    胶原水凝胶可携带BMP-4或碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），与牙髓细胞混合并移植到大鼠体内后能够检测到DSPP的产生。胶原水凝胶还可携带血管原性生长因子（angiogenic growth factors，AGF）与牙髓细胞，促进根管中结缔组织的形成。
    交联肉桂醛后的胶原水凝胶可以促进人DPSCs的增殖和牙源性分化，抗压强度和表面粗糙度增加，凝结时间明显缩短。由上述研究可知，胶原类支架材料可诱导根管内产生更多的新生组织，且其组分和结构多样，在牙髓再生治疗中具有非常有益的特征；但也有研究表明使用胶原支架会比不使用导致更明显的炎症反应、更多的牙根和骨吸收。
    1.5丝
    丝作为支架可用于软硬组织工程。丝的成分为丝素蛋白（silk fibroin，SF），而SF是一种酶促可降解材料，可以加工成不溶于水的植入物，如可注射水凝胶和多孔海绵。SF还具有良好的抗凝血活性和促进再生作用的能力，良好的机械强度、弹性、透气性、渗水性以及缓慢的降解速率。
    Meinel等通过大鼠进行移植实验，结果表明：丝与聚乳酸（polylactic acid，PLA）或胶原相比，炎症反应和免疫原性更低，生物相容性更高。Yang等发现：使用复合bFGF的SF支架，通过体外诱导DPSCs，生成具有良好的血管分布、新的基质沉积和牙质样组织形成的类牙髓样组织。目前SF应用于牙髓再生方面的研究仍比较缺乏，还需要更多的实验来验证SF是否具有较其他支架更好的性能。
    1.6脱细胞ECM
    除血细胞之外，人体组织中的大部分正常细胞是锚定的，位于称为ECM的固体基质中。组织工程的最佳支架应该是天然状态下的ECM，微环境是非常重要的。脱细胞ECM基本保存了微环境和纤维蛋白，提供了细胞定位并有利于调节未来的细胞活性，可能是组织再生的理想支架。
    已有研究成功实现了人牙髓的脱细胞处理，所产生的支架支持干细胞增殖和分化成矿化组织。脱细胞ECM可以说是一种自/异体移植物，可从拔除的健康第三磨牙中提取，来源广泛、容易获取是其优势。
    2.人工合成的支架
    人工合成的支架常具有更可控的降解率和物理机械性能，但生物相容性较差。
    2.1聚合物
    许多人工合成的聚合物，如PLA、聚-L-乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物（polylactic-co-glycolic，PLGA）、聚ε-己内酯（polyepsiloncaprolactone，PCL）、聚二氧环己酮（polydioxanone scaffold，PDS）和聚乙二醇聚乳酸（polyethylene glycol polylactic，PEG）等可用作牙髓再生的支架。这些聚合物无毒害，可达到生物降解，并能对物理化学性质，如机械强度、降解速率、孔隙率和微观结构进行精确控制。
    Gotlieb等将人脱落乳牙干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）接种在合成的PLLA等支架上，植入人前磨牙根管中，通过扫描电子显微镜观察添加或不添加BMP-2、TGF-β2的PLLA支架或胶原支架的超微结构，结果发现：不同支架类型和支架是否添加生长因子对细胞附着的影响几乎没有差异。
    El-Backly等将兔DPSCs接种于PLGA上，并植入家兔皮下，12d后观察到牙骨质及管状牙本质形成。Cordeiro等将人脱落乳牙牙髓干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）接种到PLLA上，置于牙本质薄片上并移植入裸鼠皮下，14~28d后观察到血管化的牙髓样组织和成牙本质细胞形成。聚合物支架的生物相容性较天然支架可能差一些。
    Leong等将释放甲硝唑和克林霉素的弹性冻干胶原支架与PLGA进行比较，接种人DPSCs7d后，释放甲硝唑和克林霉素的弹性冻干胶原支架接触的细胞更健康，而与PLGA接触的细胞显示出退化和凋亡迹象。抗生素联合聚合物支架，如二联抗生素糊剂（double antibiotic paste，DAP）-PDS支架、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）-PDS支架、三联抗生素糊剂（triple antibiotic paste，TAP）-模拟PDS聚合物纳米纤维支架等，均具有明显的抗菌效果。
    将来如果抗生素联合聚合物支架能取代根管内化学消毒的步骤，将大大缩短牙髓再生治疗的就诊频次和疗程，但同时要考虑到抗生素对干细胞增殖的抑制作用。
    2.2生物陶瓷
    生物陶瓷支架是指钙-磷酸盐类材料（calcium phosphate-based，Ca-P）、生物活性玻璃和玻璃陶瓷等。最常用的是Ca-P生物陶瓷。Ca-P支架包括β磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）和羟磷灰石（hydroxyapatite，HA），目前已经广泛用于骨再生。TCP和HA的钙磷比例不同。
    HA具有骨诱导性和骨传导性，是骨组织的优良替代材料，但在体内几乎不降解；与HA相比，TCP可降解并且能通过释放钙、磷离子促进组织矿化。Miura等将SHEDs与HA-TCP混合后移植到小鼠体内，发现有牙本质、骨和牙髓样组织的形成。Goudouri等发现镁基玻璃陶瓷具有较高的机械性能和生物活性。Kushwaha等成功地在添加铌的氟磷灰石玻璃陶瓷表面上培养出人类间充质干细胞。
    Lim等在掺入地塞米松和生物活性玻璃纳米颗粒的纳米纤维基质上培养出人牙髓细胞（human dental pulp cells，hDPCs），并发现该基质可促进细胞的增殖。生物陶瓷类材料的缺点是成形困难，机械强度差，脆性大，降解速率缓慢以及密度高。这些特性可以通过改变其成分和结构而加以修改。比如向纯TCP支架中添加SiO2和ZnO，可增加其机械强度以及细胞增殖活性；改变支架的孔径和体积，也会影响其机械强度。总之，生物陶瓷支架在单独使用时缺点十分明显，因此目前常与其他材料复合应用。
    2.3复合支架
    为了克服单一支架材料的缺点，将两种或多种材料进行复合是支架材料研制中的新方向。Agrawal等发现：将生物陶瓷结合聚合物（如羟磷酸钙结合PLA），不仅有助于防止因聚合物降解引起的pH值下降及无菌性炎症，同时复合后的材料在强度、脆性、孔隙率和降解性等方面兼具两种材料的优点。
    Fu等将BMP-2与PLGA/HA复合纤维支架以不同的方式结合，移植到裸鼠体内，观察6周后发现：从PLGA/HA复合纤维支架释放的BMP-2的生物活性保持良好，进一步改善了新骨形成和愈合。自组装含肽水凝胶是新型生物材料支架。因其中心肽段分别由亲水性和疏水性的氨基酸残基交替组成，从而具有很强的自组装性。成胶前，可以先和细胞或生物活性分子（如生长因子）预混，在盐溶液中，肽段会自组装形成透明的三维凝胶结构。这种自组装性使其拥有广泛的应用前景。
    Galler等将SHEDs和DPSCs分别接种在自组装多肽水凝胶中，观察4周后发现：干细胞都能进行增殖和分化，凝胶也都发生了降解；SHEDs表现出较高的增殖率和胶原形成量，产生更多软组织，而DPSCs的增殖率虽较低，但可观察到矿化现象、成骨样细胞表型和相关基因表达。
    除上述支架外，还有各种复合支架，如生物活性分子-生长因子-干细胞模拟ECM支架、胶原-藻酸盐牙胶尖支架、胶原-HA支架、氟磷灰石（fluorapatite，FA）-PCL支架、PDS-埃洛石纳米管（halloysite nanotubes，HNTs）支架等等，它们可以在一定程度上取长补短，具有广阔的研究前景。
    3.小结
    目前尚未有理想的牙髓再生支架材料问世，期望未来有更多关于复合支架的研究能够打破单一支架的局限性。牙髓再生治疗的方法和步骤仍在不断改进和探索中，将来通过更先进的支架材料和大量的病例研究可以规范牙髓再生治疗，提高其治疗的成功率，获得真正的牙髓再生。