牙本质作为骨修复材料的研究进展

    牙周疾病、肿瘤、感染及外伤等均可造成口腔骨组织缺损，不仅会引起口腔颌面部形态异常与功能障碍，也会为缺失牙的种植修复带来困难。骨缺损治疗的热点之一是利用组织工程学，以生物材料为支架，搭载患者自身干细胞，联合生长因子实现骨组织再生，而其瓶颈在于缺乏理想的成骨材料。
    目前常用的骨修复和移植的材料主要包括自体骨、同种异体骨、异种骨及人工合成骨。各种材料特性不一，但均有其各自的缺点与不足：自体骨成骨效果最佳，但来源非常有限，易引起供区并发症，对患者造成额外的创伤与疼痛；同种异体骨与异种骨来源较丰富，但存在免疫排斥的风险，并可能导致交叉感染；人工合成材料不会造成疾病的传播，但其诱导骨生成的能力较弱，且生物相容性较差。因此，寻找同时具有骨传导性、骨诱导性、生物相容性和可吸收性等优良特性的新型成骨材料逐渐成为研究的热点。
    牙本质与牙槽骨有相同的组织学来源，成分构成与骨组织相似。Yeomans与Urist于1967年发现了兔牙本质具有骨诱导性，并提出其诱导骨再生的方式主要为软骨内成骨。近年来国内外许多研究表明，牙本质作为生物支架材料，可提供三维生长空间并模拟细胞外基质，对成骨相关细胞如成骨细胞（osteoblasts，OB）、破骨细胞、牙囊细胞、骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的生长、增殖与分化有明显的促进作用，具备良好的骨传导、骨诱导作用及生物相容性。因此，牙本质作为一种新型骨修复材料备受关注。本文对牙本质材料的成骨机制、处理方法及其临床应用进行综述。
    1.概述
    人牙本质来源广泛，可取自临床治疗中拔除的废用牙或阻生齿，且富含多种骨活性分子。牙本质与牙槽骨有相同的组织学来源，均起源于胚胎时期的神经嵴细胞，钙磷含量及成分构成均与骨组织相似，用作骨修复材料时具有其他材料无法比拟的天然优势。
    人牙本质主要由质量分数65%无机成分与35%有机成分构成，其中无机成分以羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）为主，还有β磷酸三钙、无定形磷酸钙与磷酸八钙等。牙本质有机成分中，Ⅰ型胶原约占90%，其网状结构由3股超螺旋结构的胶原相互凝聚交联而成，可将矿化结晶及其他有机组分，如非胶原蛋白（non collagenous proteins，NCPs）、蛋白多糖、脂质等容纳沉淀于其中。
    此外，牙本质中还贮藏有丰富的生物活性分子与生长因子，如骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。
    Avery等利用酶联免疫吸附试验对脱矿牙本质基质（demineralised dentine matrix，DDM）中的生长因子进行定量分析，结果显示TGF-β1含量最高，达到15.6ng·mg-1，余依次为BMP-2、FGF、VEGF及PDGF，其含量分别为6.2、5.5、5.0、4.7ng·mg-1。牙本质这种独特的组成结构（无机成分、NCPs、生长因子与活性分子），赋予了其在骨组织工程学中作为生物支架搭载种子细胞，持续释放生长因子，发挥骨诱导性以促进新骨生成的潜能。
    2.牙本质作为骨修复材料的成骨机制
    牙本质诱导骨再生的过程是一个多种细胞参与、多种通路作用并受多种细胞因子调控的复杂网络，其具体机制尚不明确，研究表明可能与其无机成分及独特的有机构成有关。牙本质的无机成分主要为HA。Maeda等证实HA可促进OB的迁移从而调节骨诱导能力的表达。牙本质中的有机物约90%为Ⅰ型胶原，不仅可为骨再生提供原料，而且还是各种生长因子的优良载体。
    Wang等发现：Ⅰ胶原可通过细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）信号转导途径诱导BMSCs分化为OB，并调节成骨特异性转录因子的基因表达以增强成骨功能。在第三磨牙拔牙窝中使用Ⅰ型胶原蛋白，术后拔牙窝部位的矿化率显著增加。
    BMP也是牙本质中含量丰富的有机物质，是一种能促进异位成骨的分泌型多功能蛋白，参与调控OB生命周期的各个方面，包括骨原细胞扩增、OB矿化及其与破骨细胞的偶联等，并可通过印度豪猪蛋白（indian hedgehog，IHH）来诱导BMSCs分化为软骨细胞和骨组织，进而参与成骨和破骨的过程。
    Choi等在比格犬骨缺损处分别植入10、50、200μg·mL-1的BMP，16周后通过CT检查观察到实验组平均再生骨厚度与面积显著大于对照组，且50μg·mL-1是最佳质量浓度。BMP单独使用时易被各种蛋白酶水解，需要与适当载体形成复合生物支架来发挥其功效。牙本质中的无机成分作为载体与BMP形成复合生物支架可有效抵抗酶的降解，并可与BMP形成缓释系统，在骨缺损区持续释放BMP，与其他生长因子相互作用，协同促进骨再生的同时提供矿化所需基质。
    NCPs广泛存在于牙本质、牙骨质及骨等矿化组织中，包括牙本质磷蛋白（dentin phosphoprotein，DPP）、牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）、牙本质基质蛋白（dentin matrix protein，DMP）、骨涎蛋白（bone sialoproteins，BSP）、骨钙蛋白（osteocalcin，OC）和骨桥蛋白（osteopontin，OPN）等。NCPs在骨组织矿化过程中起重要作用。
    Yu等从健康的人类牙齿中分离出DMP，通过体外实验发现DMP可增强BMSCs的碱性磷酸酶活性和矿化作用，并上调成骨分化相关标志物的表达。还有学者发现DMP可改变成骨基因的表达，对骨骼重塑和矿化的速度、OB与破骨细胞的形态和活性有重要调节作用。
    OC与OPN也分别被报道在磷灰石晶体成核、颌骨的生长和发育及牙槽骨的矿化中发挥作用。VEGF是血管形成最重要的生长因子，在OB和血管内皮细胞之间起重要连接作用，可增加OB的迁移率，从而促进新骨形成。Reis-Filho等用牙本质充填大鼠上颌第二磨牙拔牙创，结果显示在7、14d后VEGF表达明显增加，并伴有新生血管与新骨生成，拔牙创愈合也早于仅填有血凝块的对照组，表明牙本质可激活VEGF表达从而具有骨诱导作用。牙本质的无机成分及Ⅰ型胶原、BMP、NCPs、VEGF等有机成分在成骨过程中发挥重要作用，但每种成分的具体作用机制及诱导骨再生的上下游信号通路尚需进一步明确。
    3.牙本质骨修复材料的处理方法
    牙本质中含有大量的潜在性抗原物质，如脂类、胶原蛋白、蛋白多糖等，且成牙本质细胞突起也可引起免疫排斥反应，因此在植入之前，为提高成骨活性，降低感染和免疫排斥反应等风险，需经过一定的处理，以消减牙本质的抗原性。
    3.1脱矿处理
    牙本质含有大量高矿化、高结晶、低孔性的HA成分，这会产生物质屏障作用，阻止液体的浸润，使生长因子不易释放，干扰OB与MSCs的迁移、附着和分化，因此需去除部分矿物质以提高孔隙率从而促进成骨效果。Um发现：脱矿后的牙本质由于孔隙增加，可作为骨组织工程学所需的生物支架，也可作为rhBMP-2的载体，促进rh‐BMP-2等生长因子的释放，从而具有骨诱导性。
    除此之外，脱矿可提高牙本质骨传导性，对成骨相关细胞的增殖起促进作用。Bono等将成骨细胞样细胞接种至脱矿牙本质材料表面，观察到明显的细胞黏附、增殖与分化。Koga等还发现，相较于未脱矿质牙本质及完全脱矿牙本质，部分脱矿的牙本质基质促进OB黏附与诱导新骨形成的能力最强。因此，适当的脱矿不会破坏牙本质中天然蛋白质的构象及生长因子的活性，也不会抑制BMP骨诱导作用。
    相反，脱矿牙本质由于去除了无机物，HA结晶度变低，牙本质小管增宽，孔隙增加，可使BMP等生长因子的生物利用度增加，碱性磷酸酶活性增强，成骨相关细胞增殖及分化能力提升，从而为新骨形成提供更好的空间支撑。这些特性使得脱矿作为处理牙本质的首选方法，被广泛应用于牙本质骨修复材料的加工中。
    3.2煅烧处理
    牙本质在煅烧后具有良好的生物相容性，可作为支架为骨组织生长提供结构支持，还可提供钙和磷等必要的成分。郭津源等将锻烧处理的牙本质与富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）联合使用修复兔颅骨缺损，发现其能与自体骨形成良好骨结合，且随着自体骨的再生逐渐被吸收，具有良好的生物相容性和成骨作用。
    Kim将拔除的牙齿置于1200℃熔炉中煅烧，然后研磨成直径小于149μm的牙本质颗粒，与氢氧化钙以2∶1的质量比混合植入骨缺损处，发现成骨效果良好，表明煅烧处理后的牙本质具有良好的生物相容性，能与骨组织形成较强的化学结合，具有骨传导作用。
    3.3冷冻处理
    Atiya等拔除新西兰大白兔上下颌中切牙提取牙本质，于液态氮中冷冻20min后再放置室温下15min，然后将其浸泡在0.2mL庆大霉素和5mL70%乙醇混合液中30~60min，随后将其研磨成直径2~4mm的小颗粒植入骨缺损处，结果显示：新生骨小梁与牙本质融合，且骨密度与空白对照组相比更高，表明液氮冷冻处理的牙本质具有骨传导和骨诱导双重特性。
    3.4脱蛋白处理
    牙本质是致密的矿化组织，脱蛋白加工可提高其孔隙率及增大孔径，有利于新血管形成和细胞浸润，发挥HA等磷酸钙的支架作用，可有效促进骨再生。Fichant等对牙本质进行脱蛋白处理，扫描电子显微镜下观察到材料表面出现由胶原纤维消失所形成的新孔隙，使牙本质表面的孔隙率增大到约20%。
    Tabatabaei等在模拟人体液中观察到：脱蛋白牙本质比脱矿及天然牙本质具有更高的HA晶体形成速率，且对培养的人牙髓干细胞表现出更好的细胞黏附和促分化能力。除此之外，脱蛋白可降低牙本质的弹性模量与硬度，使其与现有的支架材料性能更加接近。但有学者认为牙本质脱蛋白后会失去生长因子、NCPs等骨活性物质，降低骨再生作用，因此该处理方法还有待进一步研究。
    3.5煮沸处理
    煮沸法是基于高温使酶失活的原理，使蛋白质变性以降低牙本质的免疫原性。Moharamzadeh等将拔除的小牛牙齿制备成直径5~10mm的颗粒状牙本质，放置蒸馏水中煮沸2h，再用异丙醇脱脂2h去除残留物质，冲洗、烘干、消毒后植入牛的牙槽窝内，结果发现：煮沸处理的牙本质能促进成纤维细胞的增殖和活性，且随着时间延长逐渐被新骨替代，具有良好的骨诱导能力，并且由于去除了抗原性物质，所以生物相容性良好。
    3.6提取NCPs
    牙本质中NCPs含量丰富，可将其单独提取后加工，得到生物活性物质，用于与其他材料的交联、改性等。NCPs作用多样，不仅可调控和促进OB的黏附、增殖与分化，参与生物矿化HA成核阶段，引导未分化间充质细胞内的信号传导级联反应，还可诱导人牙周膜干细胞的成骨向分化。
    有学者用溶解的DDM蛋白提取物培养牙髓干细胞，发现DDM可刺激细胞扩张，抑制凋亡标志物caspase3的表达，上调细胞存活标志物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（serine/threonine-protein kinases，Akt1），并促进细胞的矿化基质沉积。综合这些研究结果可见，NCPs被提取后可作为生物活性因子搭载至支架材料，在骨组织工程学中具有广阔的应用前景。
    目前对牙本质处理采用最多的仍为脱矿处理，而对其他处理方式如煅烧、脱蛋白及煮沸处理等探讨较少。未来应继续对牙本质的加工工艺进行探索，寻找新的处理方式，以最大程度地发挥其成骨潜力。
    4.牙本质作为骨修复材料的临床应用
    牙本质促进骨再生能力在许多动物实验中已得到证实，近年来多项临床研究表明：牙本质作为骨替代材料在种植治疗、引导骨再生、上颌窦提升、牙槽嵴提升等多项临床治疗中也取得了良好效果。Schwarz等将自体牙本质片用于牙槽嵴骨增量，术后24周发现牙槽嵴宽度增加了4.5mm，且种植体稳定性良好。
    Melek等将患者自身拔除的前牙与前磨牙制成牙本质颗粒即刻回植，术后3个月影像学观察可见平均骨量增加23.47%，6个月后平均骨密度增加30%。一项包含38例患者的前瞻性研究将牙本质用于恢复水平或垂直牙槽骨高度，结果显示伤口愈合良好，组织学检查可见新骨形成。
    Kim等对DDM植入种植体周围的5个病例随访5年，发现在种植体周围有皮质骨及松质骨形成且维持良好；将患者自体根部牙本质制备成牙本质块，放置于种植体周围骨缺损部位，术后观察44个月，22例患者中18例均未出现种植体周围边缘骨丧失。
    Minamizato等采用DDM分别进行牙槽窝保存术（7例）、牙槽嵴提升术（6例）和上颌窦底提升术（3例），随访结果显示所有患者的植骨部位均愈合良好，无并发症出现，表明牙本质具有良好的成骨能力与生物相容性。与现有骨修复材料相比，牙本质也展现出相近甚至更优的临床疗效。
    Kim等为2组行上颌窦提升术的患者，分别同时植入牙本质颗粒与人工骨粉，1年后发现2组上颌窦底到牙槽嵴顶之间的骨吸收量无明显差异。Pang等将Bio-Oss骨粉和DDM分别用于拔牙位点保存并植入种植体，结果显示：2组垂直骨增量、术后种植体稳定性均无明显差异。
    吴峥嵘等对下颌第一磨牙根分叉病变患者分别使用牙本质颗粒联合PRF及Bio-Oss骨粉作为骨修复材料，经过1、6、12个月观察，发现牙本质颗粒组根分叉区骨密度优于Bio-Oss骨粉组。还有研究比较了自体牙本质与骨移植“金标准”自体皮质骨在骨增量中的效果，结果显示2种材料的水平骨增量无明显差异。
    5.总结和展望
    综上，牙本质作为骨修复材料具有良好的骨诱导性、骨传导性与生物相容性，在动物实验与临床应用中均表现出良好的成骨效果。牙本质的来源广泛，加工简单，成本低廉，免疫原性较低，且与临床常用的骨修复材料成骨效果相当甚至更佳，应用前景广阔。但目前对牙本质诱导成骨的具体机制尚不明确，且现有的牙本质骨修复材料需经过脱矿、消毒、研磨等一系列流程处理方可用于临床，加工过程繁复，耗时较长，在一定程度上限制了其应用。未来需进一步深入研究牙本质作为骨修复材料的成骨机制，并拓展其他处理方式，同时评估其成骨的长期效果，以期早日广泛应用于临床。