活性氧类在慢性牙周炎所致骨吸收中的研究进展

    牙周炎是一种以牙周组织炎症反应为特征的慢性感染性疾病，其发病无地域、民族和年龄差异，近年牙周炎的发病率逐年升高。牙周炎主要由菌斑微生物引发的宿主免疫反应引起，病情逐渐进展，最终引起机体牙齿支持组织的渐进性破坏。
    牙周炎的发病机制主要与一些具有高蛋白酶和免疫抑制特性的宿主微生物有关，如常见的牙龈卟啉单胞菌。牙周炎的发病机制复杂，随着近年口腔医学的发展，认为牙周炎还可通过一些复杂的生物及信号因子激活某种通路，最终损伤牙周组织。
    牙周炎是导致成人牙齿损伤甚至缺失的主要原因，在诸多牙周炎的发病机制中，过量活性氧类（reactive oxygen species，ROS）产生的氧化应激而造成的骨破坏成为目前牙周炎骨吸收的研究热点。
    研究证实，牙周组织的损伤多由白细胞、补体和ROS参与的宿主免疫反应导致，机体在启动宿主免疫反应后，中性粒细胞成为牙周组织和龈沟中最常见的炎症细胞，通过由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）促进的呼吸链代谢途径产生过氧化氢、超氧阴离子和羟基自由基，上述物质统称为ROS。
    在生理条件下，大部分ROS经细胞内线粒体呼吸链途径产生，机体产生的抗氧化剂能有效中和ROS或修复ROS诱导的组织损伤，从而抵消氧化应激的有害作用。当炎症发生时，ROS产生急剧增加，高水平或高活性的ROS不能被抗氧化防御系统平衡，过剩的ROS导致氧化应激和组织损伤。
    相关研究表明，过量ROS堆积对牙周组织的损伤过程主要分为两个途径：①ROS可直接引起组织损伤，涉及脂质过氧化、DNA损伤、蛋白质损伤和重要酶的氧化；②ROS可作为信号分子或炎症介质激活相关信号通路，引起炎症反应和组织损伤。现就过量ROS产生的氧化应激在牙周炎骨吸收中的相关信号通路予以综述，以期为进一步明确ROS与牙周炎的病理机制提供依据，并为牙周炎治疗提供思路。
    1.ROS与氧化应激
    氧化应激是指体内游离基代谢障碍导致的氧化与抗氧化系统失衡，该失衡状态更趋向于氧化作用。氧化应激可导致机体产生大量的氧化中间产物，从而引起组织损伤。相关研究证实，过量ROS累积是导致机体发生氧化应激的直接因素，ROS在氧化应激过程中是调节细胞生长、分化、衰老和凋亡的信号分子。
    ROS作为体内氧的还原代谢产物，具有强氧化能力，在正常生理条件下，ROS和抗氧化剂之间呈平衡状态，两者共同构成完整的抗氧化系统。机体因炎症刺激等因素持续产生过量的ROS，进而导致抗氧化系统失衡，引起氧化应激，造成机体细胞内脂质过氧化、DNA和蛋白质损伤以及相关的酶氧化，从而激活相关信号通路，加重炎症反应，最终导致组织损伤。
    目前已知的ROS激活氧化应激的相关途径主要有核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路、核转录因子红系2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）信号通路、促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路等。
    目前关于ROS与氧化应激之间机制的研究较多，但是缺乏大量循证医学证据。机体的氧化还原平衡处于不稳定状态导致ROS过量累积，促使机体出现氧化应激反应，而牙周组织中的氧化应激反应也基于上述信号通路，因此，进一步探究牙周组织中ROS与氧化应激之间的病理机制，可为牙周炎治疗奠定理论基础。
    2.牙周炎与ROS
    近年来，ROS与牙周炎的关系逐渐受到关注。在牙周炎的病理进程中，中性粒细胞是抗牙周致病菌的第一道防线，在病原体的刺激下，中性粒细胞通过NOX促进的呼吸链代谢途径产生超氧阴离子，并将其释放到噬菌体和细胞外环境中，转化为不同的自由基和非自由基衍生物，如过氧化氢、羟基自由基、次氯酸和单线态氧；在病原生物膜启动宿主反应后，中性粒细胞是牙周组织和龈沟中最常见的炎症细胞，被认为是牙周炎中ROS的主要来源。
    因此，牙周组织中炎症反应与ROS之间的关系受到关注，研究发现，牙周炎患者血清、唾液以及龈沟液中ROS代谢物含量增加，总氧化状态水平升高，且牙周炎患者外周血中性粒细胞中ROS的活性高于健康个体。
    另有研究表明，即使没有任何刺激，牙周炎患者中性粒细胞释放的细胞外ROS亦多于健康对照组。Shaheen等发现，牙周炎患者龈沟液中的氧化应激标志物水平与牙周袋探诊深度、龈沟出血指数及附着水平呈正相关，经牙周治疗后，患者机体的氧化应激标志物水平改善。
    Tamaki等指出，经牙周基础治疗后，牙周炎患者血清ROS水平及牙周指标均较治疗前明显降低，证实牙周炎相关临床参数与ROS存在相关性。Zeidan-Chulia等对健康人、牙周炎以及牙周炎并发糖尿病患者牙龈组织的免疫组织化学分析显示，牙周炎患者牙龈组织中基质金属蛋白酶7的表达与ROS活性升高相关。
    相关研究发现，ROS可以提高基质金属蛋白酶的活性，并进一步刺激牙周膜成纤维细胞分泌白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β等产生相关炎症反应，加剧破骨细胞分化，最终破坏牙周组织，甚至导致牙齿脱落。
    综上，ROS与牙周炎发生发展关系密切，进一步完善牙周炎与ROS之间的机制研究能够为牙周炎的预防和治疗提供一定的理论依据。
    3.ROS与牙槽骨吸收
    牙槽骨是牙周组织的重要成分，当各种病理因素导致牙槽骨吸收时，牙齿的支持组织丧失，进而出现牙齿松动，最终导致牙齿脱落。过量ROS堆积被认为是牙周炎中骨破坏性疾病的促进因素之一，ROS介导细胞内信号分子生成破骨细胞是牙槽骨吸收的关键。骨稳态可维持成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收之间的平衡，来源于骨髓单核/巨噬细胞系的破骨细胞，通过一系列增殖、分化和融合，最终发育为成熟且唯一能吸收矿化骨的多核巨细胞。
    成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收之间的平衡主要经核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）/核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）/骨保护素信号通路转导，从而维持骨稳态；作为环路调节系统，RANKL/RANK/OPG信号通路通过调节破骨细胞活化参与骨重建，发挥关键作用。
    另有研究发现，ROS可激活NF-κB信号通路并促进IL-6、IL-1β、IL-1、IL-2、肿瘤坏死因子-α、前列腺素E2和淋巴毒素等的分泌，上述细胞因子及趋化因子与牙周组织的骨吸收有关，其中前列腺素E2是牙周骨吸收最有力的刺激因素；IL-1和肿瘤坏死因子-α在牙周炎中能启动组织破坏和骨吸收；IL-1是骨脱矿的最有效诱导因素；IL-6可刺激破骨细胞分化和骨吸收，并抑制骨形成；而涉及破骨细胞形成的关键因子包括RANKL、肿瘤坏死因子受体相关因子6和NOX等，且NOX同源物NOX1和NOX2可在破骨细胞形成过程中相互作用并产生ROS。
    综上，ROS除可直接引起组织损伤外，还可在破骨细胞形成过程中发挥间接作用，导致牙周骨组织变性。ROS可通过激活NF-κB信号通路导致牙槽骨吸收，在牙周炎病程进展中起重要作用。ROS信号通路还可促成MAPK、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）和NF-κB的活化，NF-κB是第一个对ROS应答的转录因子，可介导NF-κB抑制蛋白α的磷酸化及降解。使用抗氧化剂预处理破骨细胞可抑制其氧化，并降低由RANKL诱导的蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）、NF-κB、胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）的活化，证实ROS在牙周骨破坏中起关键作用。
    另有研究发现，应用抗氧化剂激活MAPK级联反应可抑制破骨细胞前体对RANKL的反应，由RANKL介导的ROS可诱导Ca2+的持续振荡，从而激活活化T细胞核因子c1，促使破骨细胞形成，进一步导致牙周骨破坏。此外，Nrf2可启动多种抗氧化酶，从而降低ROS引起的牙周损伤。
    由此可见，ROS在牙周炎进程中发挥重要作用，可通过NF-κB、MAPK以及Nrf2等信号通路介导破骨细胞活化，进而导致牙周骨组织及软组织破坏。
    3.1ROS和NF-κB信号通路
    NF-κB是炎症的主要调节因子，也是第一个被发现的对ROS应答的转录因子，可调控数百个与免疫反应相关基因的表达，在氧化应激与炎症的调节中具有重要地位。在牙周炎导致的骨炎症状态下，淋巴细胞大量产生RANKL，RANKL是破骨细胞生成必不可少的因素之一，可作用于RANK受体，诱导肿瘤坏死因子受体相关因子6募集，进而激活多个下游靶点，包括MAPK和NF-κB通路，导致活化T细胞核因子c1的c-Fos和核因子活化。
    被激活的NF-κB还能促进趋化因子及促炎因子的分泌，进而导致炎症反应和牙周破骨细胞分化，最终造成牙周组织破坏。在破骨细胞形成和骨吸收过程中，细胞内ROS起到至关重要的作用，RANKL刺激破骨细胞前体发生肿瘤坏死因子受体相关因子6/Ras相关C3肉毒毒素亚基1/NOX1级联反应，促进细胞内ROS生成。
    Lee等研究发现，抗氧化剂（如乙酰半胱氨酸）或NOX抑制剂（如二苯碘铵）可通过抑制RANKL介导的ROS生成抑制破骨细胞生成，表明ROS是破骨细胞分化所必需的。
    综上，牙周组织中过量的ROS通过激活NF-κB信号通路过度表达相关细胞因子，进而上调破骨细胞活性，最终导致牙周骨质破坏。
    3.2ROS和MAPK信号通路
    MAPK信号通路由ERK1/2、c-Jun氨基端激酶、p38激酶和大MAPK1/ERK5通路组成，是细胞各种生命进程中发挥重要作用的主要细胞内信号转导通路。Lee等研究表明，ROS、c-Jun氨基端激酶、p38、ERK1/2的激活可介导RANKL刺激的破骨细胞分化，表明NOX1产生的超氧化物阴离子也参与了破骨细胞分化过程。
    过氧化氢处理的原代成骨细胞和骨髓间充质干细胞可刺激ERK1/2磷酸化以及磷脂酶Cγ1和ERK依赖的NF-κB活化，导致成骨细胞分化受损。Bai等的研究表明，ERK激活可介导ROS诱导的RANKL表达。而Ohyama等研究证明，RANKL能诱导ERK和c-Jun氨基端激酶的活化并促进ROS的生成，且ROS可激活c-Jun氨基端激酶信号通路，促进炎症因子生成，造成牙周组织破坏。由此可见，ROS参与MAPK信号通路，在牙周组织炎症反应中发挥重要作用。
    3.3ROS和Nrf2信号通路
    Nrf2可与靶基因启动子近端的抗氧化反应元件结合，调控转录启动多种抗氧化酶的表达，以抵抗ROS堆积导致的牙周损伤，保护细胞功能。组织发生应激损伤后，被激活的Nrf2易位到细胞核并上调抗氧化酶的表达，包括过氧化氢酶、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基以及超氧化物歧化酶。
    随后，Nrf2通过启动抗氧化酶表达，降低细胞内ROS水平，进而抑制MAPK通路和PI3K/Akt通路以及破骨细胞分化。如Nrf2通过调节抗氧化酶的表达降低细胞内ROS水平，进而抑制RANKL介导的小鼠破骨细胞生成及骨破坏。
    Zhu等的体内及体外实验发现，黄芩素（具有抗氧化和免疫调节作用）可通过Nrf2信号通路减轻氧化应激损伤，并改善牙周炎所致的牙槽骨吸收。在RANKL诱导的破骨细胞分化过程中，RANKL通过上调Keap1降低Nrf2/Keap1表达水平，进而提高细胞内ROS水平，促进破骨细胞的分化和功能。故推测，抗氧化剂可作用于ROS/Nrf2/Keap1信号通路，发挥维持骨稳态的作用。
    3.4其他信号通路
    在牙周炎的骨吸收反应机制中，除NF-κB、MAPK、Nrf2等信号通路外，ROS还参与其他信号通路的调控。Mukherjee和Rotwein发现，PI3K下游Akt信号通路是骨骼代谢中的重要信号转导通路，在细胞增殖、分化和矿化中均起关键作用，且Akt的磷酸化水平是成骨细胞成骨分化的指标。
    此外，PI3K/Akt通路的激活也可作为氧化应激的负性调节剂，从而导致牙周骨炎症进一步发展。研究表明，糖尿病患者更易并发牙周炎，可能与高葡萄糖诱导的氧化应激抑制了成骨分化及PI3K和Akt磷酸化的表达相关。牙周炎的发病机制复杂，ROS可干扰细胞内和细胞间的多种信号通路，并涉及多种机制，如炎症调节、蛋白质代谢、细胞增殖分化，仍需要进一步的研究探讨。
    4.小结
    牙周炎的骨组织破坏与过量ROS堆积引起的氧化应激相关，ROS参与了多种牙周骨吸收信号通路，被认为是牙周炎等疾病的驱动因素之一。牙周组织内ROS过度堆积会产生氧化应激反应，刺激多种细胞因子及趋化相关因子产生，通过激活NF-κB、MAPK以及Nrf2等信号通路，导致细胞功能障碍，最终促使牙周骨破坏，甚至出现牙齿脱落。因此，研究ROS调节牙周炎介导骨吸收相关信号通路的机制对于明确相关靶点有效治疗策略至关重要。
    然而，ROS在介导骨代谢中有多种功能，且无法单独评估骨骼中成骨细胞、破骨细胞的ROS水平，故需通过了解骨细胞分化过程中ROS的水平认识ROS在骨骼中的作用。ROS参与的相关信号通路具有高度复杂性，现有研究并未阐明ROS在牙周炎导致的骨吸收机制中的确切作用，随着研究的不断深入，ROS在牙周炎中的作用及机制逐渐清晰，将为牙周炎的防治提供更多方法。