微小RNA调控牙周膜干细胞成骨分化的研究进展

    牙周炎是由牙菌斑中的微生物引起的慢性感染性疾病，可导致牙周软硬组织进行性破坏，是成年人牙齿缺失的主要原因。骨量取决于成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收之间的平衡，在正常生理条件下，骨形成和骨吸收是平衡的，但牙周炎患者骨吸收过度，骨再生的能力降低，导致牙槽骨破坏。因此，牙槽骨的修复再生成为牙周炎治疗的热点。
    干细胞移植是促进牙周组织再生和重建的一种有前途的治疗策略。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是牙周组织中重要的干细胞来源，具有较强的自我更新和克隆形成能力以及成脂、成骨等分化潜能。其中成骨分化能力对牙周骨量的维持具有重要作用。
    迄今为止，在人类中已鉴定出大量的微小RNAs（microRNAs，miRNAs），miRNAs参与调节多种生物活动，如细胞分化、细胞凋亡、癌症发展以及炎症反应。目前多种miRNAs已经被证实参与PDLSCs的成骨调控，本文就miRNAs调控PDLSCs成骨分化的研究进展作一综述。
    1. miRNA的生物形成及功能
    miRNA首先由编码基因转录为初级转录产物（primarymiRNA，pri-miRNA），Pri-miRNA在核酸内切酶Drosha的作用下被裂解成长度为70~100个核苷酸的miRNA前体（precursor miRNA，pre-miRNA），以上过程是在细胞核内进行；pre-miRNA被转运蛋白运输到细胞质中，然后在核酸内切酶Dicer的作用下形成双链miRNA，随后双链miRNA被转运进AGO 蛋白中，形成RNA 诱导沉默复合体（RNA induced silencing complex，RISC），miRNA的一条链保存在RISC中，另一条链则被排出到复合体外并迅速降解，最终形成成熟的miRNA为非编码单链RNA，长度约18~25个核苷酸。
    目前miRNA 的作用机制相对明确:miRNA 靶向mRNA 3’非翻译区（untranslated region，UTR），导致mRNA降解或抑制mRNA翻译，进而抑制基因表达。有意思的是，一个miRNA 可以控制多个基因的表达，而某个基因的表达可以由几个miRNA控制。而miRNA其他的作用机制鲜有报道，仍需进一步研究。
    2. miRNA促进PDLSCs的成骨分化
    部分miRNA已被证实可作用于相关靶基因和信号通路，促进PDLSCs成骨分化。Ge等发现，miR-543过表达可促进PDLSCs成骨，荧光素酶报告实验证实ERBB2转导因子2，2（transducer of ERBB2，2，TOB2）为miR-543的靶基因，miR-543通过抑制TOB2内源性表达，上调Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）和骨桥蛋白（osteopontin，OPN）等成骨基因表达，从而促进PDLSCs成骨向分化，提示miR-543可能是治疗牙周炎骨丢失的一种潜在方法。
    Wang等发现miR-375亦可通过抑制TOB2内源性表达，促进PDLSCs成骨分化。Yan等指出过表达miR-22可诱导PDLSCs中矿化结节的形成，荧光素酶报告实验显示组蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6，HDAC6）为miR-22 的靶基因，miR-22 通过抑制HDAC6 的表达，从而促进PDLSCs 成骨向分化，提示miR-22可能成为牙周病基因修饰干细胞治疗的靶点。
    研究人员发现沉默交配型信息调节2同源物1（silent mating typei nformation regulation 2 homolog 1，SIRT1）和miRNAs在成骨过程中起着关键作用，研究人员用烟酰胺处理诱导PDLSC，检测到miR-22-3p高表达，SIRT1表达沉默，采用荧光素酶报告实验证实SIRT1是miR-22-3p的直接靶点，表明烟酰胺诱导miR-22-3p沉默SIRT1从而促进PDLSCs成骨分化，提示miR-22-3p是治疗牙周炎的新靶点。
    脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁成分，是牙周病的主要致病成分，因此，有学者用LPS作为PDLSCs的刺激物，模拟牙周炎症环境。Hong等研究发现在LPS存在的炎症微环境下，miR-200c通过抑制白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、趋化因子配体-5（chemokine-5，CCL-5），促进PDLSCs成骨分化。
    张科科等在研究中分离培养牙周炎患者炎症微环境下的PDLSCs，miR-26a-5p可通过靶向Wnt5a抑制Wnt/Ca2+ 信号通路的激活，从而在体内和体外促进炎症微环境下PDLSCs的成骨分化。
    3. miRNA抑制PDLSCs的成骨分化
    miRNA 可通过抑制靶基因和靶向相关通路抑制PDLSCs的成骨分化。Xu等研究证明miR-132通过抑制生长分化因子5（growth differentiation factor 5，GDF5）的表达和激活NF-κB 信号通路抑制PDLSCs成骨分化。Li等通过基因芯片技术分析检测到成骨分化的PDLSCs中miR-24-3p的表达水平显著降低，进一步实验证明miR-24-3p可靶向成骨分化转录因子Smad5的3’-UTR，抑制其蛋白质表达，从而抑制PDLSCs成骨分化。
    Wei等亦发现miR-21可抑制Smad5的表达，从而抑制PDLSCs成骨向分化。miR-214可通过靶向活化转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）抑制PDLSCs成骨分化。Cao等发现miR-214也可通过靶向β-catenin进而抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而抑制PDLSCs的成骨分化。王献刚等研究证实miR-124可抑制成骨细胞特异性转录因子Osterix的表达，从而抑制PDLSCs的成骨分化能力。
    Bao等同样用LPS模拟炎症微环境，导致miR-148a表达升高，随后miR-148a靶向NRP1来抑制成骨。研究人员发现肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）可通过抑制miR-21/软脂酰化磷蛋白Spry1 功能轴抑制PDLSCs的成骨向分化。此外，有学者发现尼古丁促进PDLSCs中miR-1305高表达，进而抑制RUNX2的表达，从而抑制PDLSCs的成骨分化。
    4.外泌体中的miRNA
    4.1 外泌体的概述
    研究证实miRNAs存在于唾液、血清、尿液和脑脊液等体液中，是潜在的生物标志物和治疗靶点。这些细胞外miRNA分为两类:囊泡相关型和非囊泡相关型。在囊泡相关型中，miRNAs存在于外泌体（exosome）和微泡中；在非囊泡相关型中，miRNAs与Ago蛋白、高密度脂蛋白或其他蛋白质复合物相结合。
    其中，外泌体是近年来的研究热门领域。外泌体是细胞分泌的直径约40~100nm的球状小囊泡，其内含有miRNAs、mRNAs、蛋白质和脂质等组分。越来越多的证据表明外泌体通过这些组分作为信息分子在细胞间通讯发挥重要作用。
    4.2 外泌体中的miRNAs对PDLSCs成骨分化的调控作用
    Lv等发现，机械张力诱导的成骨细胞来源的外泌体促进了PDLSCs的成骨分化，高通量miRNA 测序表明，miR-181b-5p表达上调，并通过BMP2/Runx2促进PDLSC成骨分化，提示其可能是维持牙周内环境平衡的机制之一。有学者研究接受P2X7R基因修饰的细胞通过外泌体介导的旁分泌机制对PDLSCs产生影响。
    该研究证实P2X7R基因修饰的干细胞中的外泌体促进了炎症微环境中PDLSCs成骨分化；外泌体中的miR-3679-5p、miR-6515-5p和miR-6747-5p高表达，miR-3679-5p、miR-6515-5p和miR-6747-5p可通过靶向Grem-1上调RUNX2等成骨基因，从而促进了炎症微环境中PDLSCs的成骨分化。
    5.总结
    在miRNA调控PDLSCs成骨分化的过程中，有众多转录因子及信号通路参与，每种因子和信号通路都处于十分复杂的调控网络之中，有一些因子及信号通路未被发现，更多的机制尚未明确。但随着技术的发展，相信未来对miRNA的研究更加深入。因此，进一步加强miRNA对PDLSCs成骨向分化机制的研究，不仅可以扩展对miRNA复杂世界的理解，也有助于通过调控PDLSCs的分化方向，为牙周组织再生提供理论依据。